论文部分内容阅读
心血管疾病是导致全球范围人类死亡的第一疾病,而高脂血症是心血管疾病的主要危险因素之一。目前,治疗药物靶向LDL、Lp[a]和富含TG的VLDL以降低动脉粥样硬化性心血管疾病的风险。但仍存在现有药物难以治愈的严重的血脂异常,以及对现有药物的不良反应,因此对具有新降脂机制的药物研发具有迫切需求。SAK-HV是我们室前期研制的具有溶栓和抗凝功能的重组蛋白,在药效学研究中能够降低高脂Apoe-/-动物模型的血脂水平,改善肝脏脂质沉积,并在给药期内优于他汀药物的降脂效果。它在高脂鹌鹑模型、高脂大鼠模型中均产生类似的降脂效果,提示SAK-HV在高脂血症及非酒精性脂肪肝治疗中具有巨大应用潜力。药理学机制研究发现,SAK-HV诱发的特异性抗体介导了补体系统活化,进而调节肝脏脂代谢通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α的激活,表明SAK-HV诱发的免疫反应在降脂药效中十分关键。不同种属的动物各有其特点,对同一药物的反应也有所不同,而SAK-HV作为治疗性蛋白,仅在小鼠体内评估其免疫反应和降脂作用是不足的。恒河猴在种属划分上属于灵长类,脂代谢调节系统和免疫系统更加精细且与人体更为接近,高脂恒河猴模型更趋近于模拟人体内高血脂状态。为了进一步评价SAK-HV的降脂药效,我们通过饲喂高脂饮食成功构建了高脂恒河猴模型。模型组静脉注射生理盐水,给药组静脉注射相同体积0.04mg/kg的SAK-HV隔天给药7次后,检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等指标,发现在该给药剂量下SAK-HV并不能在恒河猴体内明显降低血清中的脂质水平。肝功能检测结果表明,SAK-HV并未对恒河猴的肝功能产生影响,这与前期的毒理学研究相一致,表明SAK-HV在该剂量下在恒河猴中具有良好的安全性。肝脏病理学提示,SAK-HV对肝脏脂质沉积有一定的改善,但由于动物只数有限,动物个体间存在较大差异,组间无显著差异,因此该作用尚需通过实验进一步探究。在恒河猴中,SAK-HV尽管诱导了血清中特异性抗体的产生,但补体系统并未活化,肝脏降脂通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α也并未检测到显著的活化。实验结果提示,SAK-HV诱导的不同种属间的免疫反应差异可能是造成降脂功效差异的原因。前期实验已经证实SAK-HV能够在高脂小鼠、大鼠及鹌鹑模型中实现降脂。与小鼠、大鼠相比,豚鼠对于致敏物质的反应更敏感,是免疫学研究的理想动物,而恒河猴从进化的角度来看其免疫系统及代谢系统更接近人体。因此,我们进一步研究SAK-HV处理在上述四种动物体内诱发的免疫反应差异与降脂差异的关联。在前期Apoe-/-小鼠研究确定的给药剂量和给药方式的基础上,本研究首先给予小鼠、豚鼠、大鼠、恒河猴等效剂量的SAK-HV,并对比血清中SAK-HV特异性抗体水平以及补体C3a水平,结果表明豚鼠体内SAK-HV特异性抗体水平显著高于恒河猴体内的抗体水平,并且高于小鼠和大鼠的水平,而恒河猴体内的抗体水平则低于小鼠及大鼠的水平。此外,尽管SAK-HV能够激活豚鼠、小鼠和大鼠体内的补体系统,但其并不能在恒河猴体内激活补体。豚鼠在SAK-HV给药后出现强烈的过敏反应而死亡。上述结果证明SAK-HV在豚鼠体内诱发最强的免疫反应,并存在免疫毒性,而在恒河猴体内触发的免疫反应程度低于其在小鼠及大鼠体内的免疫水平。结合SAK-HV在不同种属动物体内降脂药效的差异,我们提出SAK-HV诱发的适度免疫反应在降脂药效中具有关键作用,其在恒河猴体内没有降脂功效可能与恒河猴体内较低水平的免疫反应有关,即可能与其作为灵长类动物具备更高的免疫稳态有关。基于上述结果和分析,我们希望能通过改变药物递送途径实现免疫增效从而改善降脂功效。PLGA-PEG-PLGA（Gel）三嵌段共聚物水凝胶,具有生物相容性高、生物可降解性好以及热敏的特点,在低温（例如4℃）下是低粘度液体,可以将药物混合到聚合物溶液中以方便注射,而当温度达到生理温度时,胶束自动转变为粘性凝胶,形成原位储库,使其成为安全且可控的药物输送载体。本研究中将其用于SAK-HV重组蛋白递送,利用其以可持续的方式在体内释放抗原的特点,通过促进抗原特异性Ig G免疫应答实现免疫增效。同时,温敏和可皮下注射的PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有更安全、应用方便和依从性好的优势。药效学实验表明,在Apoe-/-小鼠体内用同样剂量的SAK-HV/PLGA-PEG-PLGA（SAK-HV/Gel）处理产生了较SAK-HV更显著的降脂效果,诱发了更高水平的免疫激活,提示适度的免疫增效确实能够改善降脂,同时也进一步验证了SAK-HV诱导的免疫反应在降脂中的重要作用。另外,我们结合转录组学、lnc RNA测序和代谢组学等多组学技术,对SAK-HV/Gel降脂机制进行了探究,结果提示有尚未报道的通路参与其降脂。差异表达基因功能分析表明SAK-HV/Gel通过促进游离脂肪酸向HDL的转化、促进脂肪酸氧化代谢、抑制脂质合成而降脂。并且,SAK-HV/Gel对免疫反应的调节在其中发挥重要角色。基于lnc RNA测序及m RNA转录组分析,我们提出lnc RNA Gm20649-Onecut1-Cyp7a1通路可能作为重要降脂路径之一,这将作为我们后续工作的重点,从非编码RNA转录的新视角揭示SAK-HV/Gel的降脂机制。同时,代谢组学和m RNA转录组分析结果共同提示脂肪酸氧化分解改变是其降脂过程中的重要环节。SAK-HV/Gel处理后肝脏差异代谢物显著富集在亚油酸代谢、酮体的合成与降解途径,为进一步阐明其降脂机制提供了线索。这些仍需要后续实验的进一步验证与探究。巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用,是先天免疫系统的重要组成部分,其细胞迁移是发挥免疫功能如吞噬、分泌和杀伤的前提条件。不同微环境下,巨噬细胞活化为不同状态参与免疫稳态的调节,并且在高脂血症、动脉粥样硬化等代谢类疾病的进展中发挥调节作用。我们前期研究发现,巨噬细胞是SAK-HV的靶细胞之一,SAK-HV可以选择性地触发其增殖,但目前SAK-HV对巨噬细胞迁移和极化的影响尚不完全清楚。在这部分工作中,我们进一步研究了SAK-HV对巨噬细胞迁移的影响,并基于RAW264.7细胞探讨了SAK-HV诱导迁移的分子机制。利用细胞划痕和transwell实验,证实SAK-HV能够通过其SAK突变域显著促进巨噬细胞迁移。机制研究中,通过筛选迁移相关通路的活化并利用抑制剂实验,发现JNK和NF-κB通路在SAK-HV诱导的细胞迁移中发挥重要作用。进一步,我们筛选了迁移相关效应分子,发现SAK-HV诱导了MCP-1的表达上调,并且MCP-1的表达受到JNK和NF-κB通路的调控。抑制MCP-1表达或干扰其特异性受体CCR2均部分抑制了SAK-HV诱导的细胞迁移。综上,我们发现SAK-HV通过激活JNK和NF-κB通路上调MCP-1的表达,从而以自分泌的方式促进巨噬细胞的迁移。此外,本研究还证实SAK-HV能够促进巨噬细胞M1转化。SAK-HV对巨噬细胞的作用加深了我们对SAK-HV调节免疫反应的认识,同时提示SAK-HV对巨噬细胞功能的调节可能参与其通过调节免疫应答实现降脂的机制。