研究背景：获得性凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物是一种罕见的出血性疾病，因循环中产生抗FⅧ：C抗体所致。人群发病率约0.2～1／100万／年。该病发病年龄较大，发生率无明显性别差异，临床表现以皮肤及肌肉出血、血尿、胃肠道出血、产后或术后出血不止等常见，关节出血少见。患者出血症状重，对常规的FⅧ替代治疗反应差，常危及生命，大约16％～22％的获得性FⅧ抑制物患者死于严重出血。获得性FN抑制物的发病机理尚未阐明，多种疾病均可导致获得性FⅧ抑制物的发生，但约50％患者无任何原发疾病。继发于大疱性类天疱疮的获得性FⅧ抑制物较罕见，迄今国际上仅报道8例，且仅限于临床分析，国内尚未见类似研究的文献报道。国外研究表明：欧美人种获得性FⅧ抑制物大多数为IgG型抗体，IgA或IgM型罕见。IgG型抗体为多克隆或双克隆起源，以工gG₄的优势表达为主，伴IgG₁或其它至少一种亚型表达。国际上对获得性FⅧ抑制物的研究集中在抑制物的免疫特性分析及抑制物作用FⅧ的结合表位研究。文献报道获得性FⅧ抑制物与FN的结合部位以A2、A3、C2区域多见，其中FN羧基端44KD和氨基端72KD片段为FⅧ抑制物的具体结合位点。本课题以1例大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物患者为研究对象，综合分析患者的临床及实验室检查特点，确定了该患者获得性FⅧ抑制物的临床和实验室诊断；对该例患者我们应用了血浆置换治疗，从临床症状、FⅧ：C活性及FⅧ抑制物滴度改变等方面动态观察了血浆置换的治疗效果；通过对FⅧ：C体外中和实验及“短暂性”获得性FⅧ抑制物动物模型的建立，证实患者体内的FⅧ抑制物对FⅧ：C具有明显的中和拮抗作用，从而强化了该病的临床诊断；应用散射速率比浊法及免疫印迹技术分析测定了患者体内IgG亚型浓度，获得了该患者FⅧ抑制物的IgG亚型分布谱；通过FⅧ／FⅧ抑制物固相结合及免疫印迹技术分析，鉴定了FⅧ抑制物IgG亚型及与FⅧ分子的结合表位，从而部分阐明了中国人种FⅧ抑制物的免疫学特性，也揭示了FⅧ抑制物发病的部分机制；为该病的临床特点认识、实验室监测及临床处理积累了新的经验。第一部分大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物患者的临床特点及诊断目的：分析大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物患者的临床及实验室特点，确定获得性FⅧ抑制物的诊断，以加深对获得性FⅧ抑制物的认识，提高对该病的诊断水平及治疗缓解率。方法：①对患者的临床出血表现、出血病史、家族史及原发病病史进行详细采集与分析；②进行活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血活酶生成及纠正试验、血小板聚集功能等实验室检查；用Ⅰ期法测定患者血浆FⅧ：C活性；以Bethesda单位（BU）确定FⅧ：C抑制物滴度；③用免疫抑制剂及血浆置换治疗，观察患者临床症状的改善与否，并监测FⅧ：C活性与FⅧ抑制物滴度变化，以判断临床治疗效果。结果：①患者的临床表现符合FⅧ缺乏的临床特点，此次起病前曾患大疱性类天疱疮，此后出现不明原因的多部位出血。患者既往无出血史及出血家族史，故出血性疾病显然为获得性因素所致。②凝血机制实验室检查结果：患者APTT∶80.5″，（正常对照：25″～35″），正常血浆不能纠正，PT∶12″，（正常对照：11″～14″），凝血活酶生成及纠正试验示FⅧ：C缺乏；Ⅰ期法测定患者FⅧ：C活性＜1.5％，FⅧ抑制物滴度为147.8 BU；③强的松结合环磷酰胺及血浆置换治疗后，患者臀部血肿逐渐吸收，四肢皮下瘀斑消退，出血症状明显缓解，FⅧ：C活性上升至13.2％；FⅧ抑制物效价下降至28 BU。结论：①确定了大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物的临床及实验室诊断。APTT及PT测定可作为出血性疾病的初筛试验，进一步的APTT纠正试验、凝血活酶生存及纠正试验、FⅧ：C活性定量及FⅧ抑制物滴度测定可明确获得性FⅧ抑制物的诊断；②免疫抑制剂及血浆置换是治疗获得性FⅧ抑制物的有效方法。二部分：FⅧ抑制物对正常人血浆FⅧ的抑制作用及对兔体内FⅧ活性的影响目的：纯化患者及正常人血浆IgG；通过体外中和试验及动物体内FⅧ：C抑制实验证明患者体内FⅧ抑制物对正常人血浆及兔FⅧ：C活性的影响。方法：①用蛋白A—琼脂糖柱分离纯化患者及正常人血浆IgG；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定纯化的血浆IgG纯度及分子量大小；②将纯化的患者IgG以不同浓度（0μg，6.25μg，12.5μg，25μg，50μg，75μg）加入正常人混合血浆中，APTT法分析其对正常人血浆FⅧ：C活性的抑制作用，以等量纯化的正常人IgG加入正常人混合血浆作APTT以资对照；③输注患者血浆入健康新西兰兔体内，测定注射血浆前30′及注射血浆后30′、60′、90′、120′时间点兔血浆APTT，观察FⅧ抑制物对兔血浆APTT值的影响，以等量正常人血浆注入新西兰兔作为对照。结果：①获得了纯化的患者及正常人血浆IgG，其分子量大小为55KD（重链）和28KD（轻链）；②加入患者纯化的IgG后，可使正常混合血浆的APTT值明显延长，并呈IgG剂量依赖性，纯化的正常人IgG不延长正常人混合血浆APTT值；③输注患者血浆入新西兰兔体内，兔血浆APTT明显延长，且以时间依赖性方式抑制兔血浆FⅧ：C活性，输注正常人血浆对兔APTT值无明显影响。结论：该大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物患者体内FⅧ抑制物抗体类型为IgG；该抗体在体内外均有明显抑制FⅧ：C活性的作用，从而强化了获得性FⅧ抑制物的临床诊断。第三部分：获得性FⅧ抑制物的IgG亚型分析及FⅧ结合表位鉴定目的：分析患者血浆及纯化的IgG各亚型（IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄）浓度；鉴定FⅧ抑制物的IgG亚型；确定患者FN抑制物“中和”FⅧ：C活性的结构性表位，揭示该病发病的分子机制。方法：①用人免疫球蛋白IgG亚型测定试剂盒，以散射速率比浊法分别测定患者及正常人血浆各IgG亚型浓度；②Western印迹技术结合灰度扫描确定患者血浆IgG亚型相对表达量；③用凝血酶消化的FⅧ蛋白，跑SDS-PAGE，然后转移胶到PVDF膜，以患者血浆孵育PVDF膜过夜（FⅧ／FⅧ抑制物固相结合试验），结合Western印迹技术，鉴定FⅧ抑制物的免疫亚型及与FⅧ结合的具体表位，同时以正常人血浆孵育的PVDF膜作对照。结果：①散射速率比浊法测定结果显示患者血浆及纯化的IgG中IgG₄浓度较正常人血浆及纯化的IgG中IgG₄浓度明显增高；而IgG₂及IgG₃浓度，患者与正常人基本相似（血浆及纯化的IgG）；患者IgG₁浓度较正常人IgG₁浓度轻度增高（血浆及纯化的IgG）；②Western印迹结果显示患者血浆的IgG₄蛋白条带灰度值明显高于正常人血浆IgG₄蛋白印迹条带灰度值；次为IgG₁；③FN／FⅧ抑制物固相结合试验及Western印迹结果显示：鼠抗人IgG₄、IgG₁抗体在FⅧ的44KD片段处存在阳性信号，提示IgG₄、IgG₁型抗FⅧ抗体与凝血酶消化的FⅧ裂解片段的44KD位点结合；用鼠抗人IgG₂、IgG₃抗体进行上述分析，无论以患者还是正常人血浆孵育，均不显示抗体与FⅧ结合的信号。结论：①本例大疱性类天疱疮并获得性FⅧ抑制物的免疫学特性以IgG₄优势表达为主，次为IgG₁表达；②FⅧ羧基端44KD（A2区域）为该例FⅧ抑制物的结合位点，从而部分揭示了该获得性FⅧ抑制物发病的分子机制。