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新鲜度是衡量水产品品质优劣的重要指标,对于建立有效的鲜度评价方法已成为食品科学领域中重要的研究内容。水产品鲜度下降是一个复杂的化学、物理、生化变化及微生物生长代谢的过程。其中蛋白质是引起水产品鲜度下降的最主要因素,但将蛋白质作为水产品鲜度评价方法的研究报道仍较少。近年来,蛋白质组学已经成为研究蛋白质的热门方法,尤其是差异蛋白组学,通过寻找、筛选和鉴定能表征水产品鲜度的指示蛋白,并全面及深入分析水产品新鲜度下降机理,旨在为水产品鲜度评价和控制提供新的思路和科学依据。因此,运用差异蛋白组学方法来研究水产品鲜度变化及作用机制具有十分重要的意义。鉴于此,本文以高经济价值和营养价值的远洋鱼类——大目金枪鱼作为研究对象,(1)采用传统品质评价方法(感官、微生物、化学和物理)系统分析金枪鱼在贮藏过程中品质变化规律,建立有效表征金枪鱼鲜度变化的综合评价模型,并确定鱼肉的货架期；(2)从蛋白质变性的角度出发,研究金枪鱼在贮藏过程中蛋白质的生化特性变化,筛选出适合金枪鱼的鲜度评价指标；(3)从蛋白质降解的角度出发,研究金枪鱼在冷藏过程中蛋白质降解规律,并分析蛋白质降解与鱼肉质构相关性,筛选出金枪鱼的鲜度评价指标,为鱼肉品质劣变机理的探讨提供理论依据和参考；(4)建立适合金枪鱼鱼肉的双向电泳凝胶体系,结合质谱技术和生物信息学手段分析鉴定差异蛋白质的结构和功能,筛选并鉴定金枪鱼冷藏过程中鲜度指示蛋白；(5)进一步结合实时荧光定量PCR对差异蛋白质的基因表达量进行分析,从基因水平验证其变化特性。主要研究结果如下：1.采用传统新鲜度评价方法,研究了金枪鱼在40C和15℃贮藏过程中品质变化。筛选出能反应金枪鱼在贮藏过程中鲜度评价指标有感官评定、TVB-N值、K值、硬度、弹性和a*/b*,pH值作为反应鱼肉鲜度的一个参考指标,而感官评定和微生物(嗜冷菌和嗜温菌)可进一步作为金枪鱼在贮藏过程中货架期判定依据；综合各指标得出金枪鱼在4℃和15℃组的货架期分别是4d和1.5d；利用因子分析了金枪鱼在不同贮藏条件下新鲜度品质变化,建立了其品质变化的综合评价模型,为全面分析其品质变化和新鲜度等级判断提供了参考和依据。2.在4℃和15℃贮藏过程中,金枪鱼鱼肉蛋白质生化特性发生了显著变化,表现在肌动球蛋白的盐溶性、总巯基及活性巯基含量和Ca2+-ATPase活性随着贮藏时间的延长,均呈下降趋势,而表面疏水性在贮藏初期阶段明显增加；总巯基和活性巯基含量可作为金枪鱼新鲜度的评价指标；且不同贮藏温度之间的蛋白质生化特性变化差异显著(P<0.05),温度越低,蛋白质变性越缓慢,生化特性越稳定。3.4℃冷藏过程中,金枪鱼肌原纤维蛋白随着贮藏时间的延长而显著下降(P<0.05),而碱溶性蛋白和TCA-可溶性肽含量则呈增加趋势；通过SDS-PAGE电泳结果表明,贮藏过程中金枪鱼鱼肉蛋白质发生了不同程度降解,降解最明显的是肌球蛋白重链；通过透射电镜观察发现,在贮藏6d时金枪鱼肌原纤维结构完全被破坏,Z线崩溃、M线和H区消失,肌节变长,肌原纤维间隙面积增大；蛋白质降解特性与鱼肉质构TPA的相关性分析,得出硬度、弹性均与肌原纤维蛋白、碱溶性蛋白、TCA-可溶性肽、肌球蛋白重链和肌动蛋白具有显著相关性(P<0.01)；肌原纤维蛋白含量、TCA-可溶性肽和肌球蛋白重链可作为金枪鱼的新鲜度评价指标。4.采用24cm,pH4-7的IPG胶条建立了覆盖范围广、分辨率高、重复性好的金枪鱼鱼肉蛋白双向电泳图谱,并利用MALDI-TOF/TOF技术和NCBI数据库比对搜索方法成功鉴定了15个差异蛋白点(2个同源蛋白质),其中12个蛋白点表达量下调,他们分别是：肌球蛋白重链-1、6-磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶同工酶M型、烯醇化酶、p-烯醇化酶(2个)、磷酸丙糖异构酶、糖原磷酸化酶(2个)、肌球蛋白轻链-1、肌球蛋白轻链-3、α-肌动蛋白和β-肌动蛋白；Ⅰ型角蛋白S8的表达量上调。5.采用实时荧光定量PCR对冷藏过程中金枪鱼鱼肉蛋白质进行基因表达水平分析,进一步验证了金枪鱼中差异蛋白质的指示效果。研究表明,8个差异蛋白质被成功转录,其中冷藏过程中烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、肌球蛋白重链-1、a-肌动蛋白和p-肌动蛋白在mRNA水平与蛋白质表达变化水平趋势相一致。6.基于GO注释对于差异蛋白质进行生物信息学分析,结果表明可初步确定10种差异蛋白点作为金枪鱼新鲜度指示蛋白,且金枪鱼在冷藏过程中新鲜度指示蛋白主要通过2条途径导致鱼肉鲜度品质下降,具体机制如下：(1)通过糖酵解代谢途径影响金枪鱼鱼肉鲜度下降：冷藏过程中5种关于糖酵解反应的代谢酶,分别是6-磷酸果糖激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶和磷酸丙糖异构酶,且它们表达下调,表明随着冷藏时间延长代谢酶快速降解,糖酵解反应速率减慢。5种代谢酶在糖酵解反应起的调控作用,可作为金枪鱼新鲜度指示蛋白。(2)通过组织蛋白酶途径影响金枪鱼鱼肉鲜度下降：冷藏过程中5种关于肌原纤维结构蛋白质,分别是肌球蛋白重链-1、肌球蛋白轻链-1、肌球蛋白轻链-3、α-肌动蛋白和β-肌动蛋白,且它们表达下调,表明冷藏过程鱼肉中组织蛋白酶加快肌原纤维结构蛋白降解,破坏鱼肉组织结构,导致鱼肉新鲜度品质下降,由此可推测该5种结构蛋白质作为金枪鱼新鲜度指示蛋白。