基于纳米花技术建立大肠杆菌O157:H7的快速检测方法

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食品安全问题逐渐成为全球关注的公共卫生问题,食品微生物污染则是全球最重要的卫生问题之一,也是导致食源性疾病的首要原因。食源性疾病自1993年至今,全球发病率呈持续上升态势,每年约发生数十亿例,仅食物引起的腹泻性疾病每年就导致220万人死亡,每天有数百万人感染,其中食源性致病菌则是主要罪魁祸首,因此我国将控制食品污染和食源性致病菌的检测列为食品安全优先重点工作。大肠杆菌0157:H7是较为常见的也是致病性极强的食源性致病菌之一,广泛存在于自然界中,如水、空气、人和动物的粪便中,严重威胁人类的生命健康。然而,一般常规的检测方法存在一系列的问题,如耗时耗力,操作繁琐,对操作人员的专业性要求较高、需要大型仪器、花费高昂、灵敏性低以及特异性不稳定等问题。因此,为了弥补常规检测方法的不足,建立一种快速、高效、可视化的食源性病原菌的检测方法尤为重要。基于有机-无机杂化纳米花技术结合BCA试剂(二辛可酸)建立大肠杆菌O157:H7的快速可视化检测方法。试验以包被链霉亲和素(SA)的96孔板作为反应平台,结合修饰生物素(Biotin)的大肠杆菌O157:H7特异性适配体,用于捕获大肠杆菌O157:H7,使其固定在微孔中,而有机-无机杂化纳米花中所包含的伴刀豆球蛋白(Con A)可以非特异性结合细菌表面的糖蛋白,使纳米花间接的固定在微孔中,利用纳米花所具有的增强酶活性及稳定性的特性,纳米花中所包埋的碱性磷酸酶(ALP)催化抗坏血酸钠(AAP)产酸,酸可以使BCA试剂由浅绿色变为紫色,肉眼可见,通过酶标仪测得其溶液的吸光值,生成标准曲线,进而可以根据颜色的深浅变化来定量检测细菌的浓度。试验中进行对适配体和纳米花的最佳孵育时间及反应体系温度进行了优化,结果是适配体和纳米花的最佳孵育时间分别为60 min和30 min,反应体系温度为室温(25℃),最低检出限可达102 cfu/mL。相较于传统的大肠杆菌O157:H7的检测方法有较大的改良,使食源性致病菌的便携、高效、可视化检测成为可能。基于有机-无机杂化纳米花、点击化学和G-四链体等技术建立大肠杆菌O157:H7的快速可视化检测方法。试验以修饰SA的磁珠作为载体,修饰在大肠杆菌O157:H7抗体上的Biotin可以与SA特异性结合,抗体特异性捕获大肠杆菌O157:H7,并将大肠杆菌O157:H7固定在磁珠上,再利用纳米花中包含的Con A将纳米花与大肠杆菌O157:H7相连,使其间接的偶联在磁珠上,加入抗坏血酸用来促进纳米花释放所包含的二价铜离子(Cu 2+),并将释放出来的Cu 2+还原成一价铜离子(Cu+),在Cu+的作用下,富G短序列上修饰的叠氮和炔可以发生[3+2]环加成反应,形成完整的G-四链体结构,加入的血红素(Hemin)包裹在完整的G-四链体结构中,使其形成具有类似于辣根过氧化物酶(HRP)特性的DNA酶(DNAzyme),在过氧化氢的同时作用下催化底物TMB显蓝色,以达到定性检测目的菌的作用。试验中进行反应条件优化:抗坏血酸的浓度优化,富G短片段浓度的优化,点击化学反应的时间以及Hemin浓度的优化。结果是抗坏血酸和富G短片段的最佳浓度分别为2 mM和5μM,点击化学的反应时间为60 min,最低检出限可达101 cfu/mL,除目的菌外其他食源性致病菌结果均显阴性,证明该实验特异性良好。该检测方法具有快速、灵敏、特异性良好等优点,在临床快速检测上具有很好的应用前景。
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