论文部分内容阅读
为了通过食疗的方法预防并治疗高血压及自由基氧化损伤等疾病，满足人类对健康饮食及医疗安全的要求，提高海洋资源利用率，研究酶法制备海洋生物活性肽成为解决问题的有效手段之一。牡蛎由于兼具丰富的营养保健及药效价值，是开发海洋生物活性肽的重要来源，同时固定化酶与切向流超滤膜系统的结合在操作结构及分离效果方面的优势在工业化生产海洋生物活性肽中具有广阔的应用空间及发展潜力。本课题主要探索了固定化酶及切向流超滤膜系统制备牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽的工艺条件，并经凝胶过滤层析及高效液相色谱对活性肽进一步分离纯化，分析其分子量分布及多肽结构特性，为研究海洋活性肽的制备工艺及构效关系提供理论支持，同时为固定化酶及超滤膜系统的工业化应用及海洋生物活性肽产品的产业化提供参考依据。主要研究结果如下：（1）以肽得率及水解度为指标，胰蛋白酶制备ACE抑制肽的优化条件为蛋白浓度50mg/mL，温度40℃，pH8.0，加酶量5000U/g，酶解时间8h，ACE抑制率达到36%-37%。制备抗氧化肽的最佳条件为温度45℃，pH为7.5，加酶量6000U，酶解时间为7.5h，DPPH自由基清除率最高达83.22%，羟基自由基清除率最高达95.69%。温度对游离酶制备牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽均具有显著性影响。（2）探索了固定化载体材料及固定化酶制备工艺，选择制备海藻酸钠及壳聚糖混合凝胶作为固定化酶的载体，正交试验优化得到共混凝胶包埋吸附法制备固定化胰蛋白酶的最佳工艺条件为0.4%戊二醛，4.5%CaCl2，加酶量1:15，吸附交联14h，酶比活力最高达128.39U/g，此法制备的固定化酶稳定性、机械强度及使用效率均有所提高。（3）优化了固定化酶酶解牡蛎蛋白制备ACE抑制肽及抗氧化肽的工艺条件。在蛋白浓度为50mg/mL条件下，得到ACE抑制率达38.82%的牡蛎ACE抑制肽，最佳制备工艺是pH为9.0，温度为50℃，加酶量为5g/g底物，反应时间为3.5h，固定化酶可重复使用五次。制备抗氧化肽的最佳工艺条件是pH9.0，温度为45℃，加酶量为3g/g底物，反应时间为1.5h，DPPH自由基清除率达到93.68%，固定化酶可重复使用七次以上，与游离酶酶解效果相比，可以获得活性更高的ACE抑制肽及抗氧化肽。（4）切向流超滤膜系统有效分离纯化一定分子量的牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽组分，经凝胶层析色谱及高效液相色谱对其分子量分布及疏水性进行分析鉴定。研究不同截流分子量超滤片段与抗氧化活性、ACE抑制率及多肽产率的关系，ACE抑制肽及抗氧化肽活性均是不同分子量肽段共同作用的结果，抗氧化肽活性主要集中在大于10kDa及小于3kDa的肽段，其中，大于10kDa肽段多肽产率及羟基清除率最高，小于3kDa肽段多肽产率其次，而DPPH自由基清除率最高。ACE抑制肽活性主要集中在小于1kDa分子量范围且多肽产率最高。通过最佳工艺扩大验证，固定化酶及切向流超滤膜系统可以制备一定分子量活性较高且性质稳定的牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽，为特色海产品的高级精深加工及海洋活性肽产品的工业化生产提供参考。