槲皮素降解菌株的筛选鉴定、代谢产物的检测及生物活性

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槲皮素具有非常广泛的潜在生物学特性,在人类日常摄食过程中,小部分槲皮素在经过小肠的吸收消化后,剩余部分则经过结肠并被结肠中的微生物群降解,而对这一过程的研究甚少,这将改变槲皮素本身的生物学特性,并对人体自身的健康有着潜在性的重要影响。本文利用体外发酵,从人源新鲜粪便中分离鉴定出能够发酵槲皮素的肠道菌种,通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)以及质谱(MassSpectrometry, MS)对发酵产物进行分离鉴定,并通过抗氧化实验、癌细胞增殖抑制实验以及对常见致病菌的抑菌试验来考察菌株发酵液的生理生化特性。研究结果如下:(1)本文通过在槲皮素胁迫作用下,从健康成人粪便中经筛选、分离以及16S rDNA分子测序,得到能够降低体系中槲皮素含量的7株菌株,分别是:大肠埃希氏菌(Escherichia coli),巴黎链球菌(Stretococcus lutetiensis),嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),融合魏斯氏菌(Weissella confusa),灰黄色肠球菌(Enterococcus gilvus),产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)。并且通过验证实验证明产气荚膜梭菌(C. perfringens)和脆弱拟杆菌(B. fragilis)能够降解槲皮素95%以上,且生成某未知物,而剩余菌株则能够部分降低体系中槲皮素含量,故该7株肠道菌株具有不同程度的槲皮素降解率和不同的降解方式。(2)通过收集产气荚膜梭菌(C. perfringens)和脆弱拟杆菌(B. fragilis)中的未知组分,经MS检测后对比特征性分子离子碎片,鉴定出未知物代谢产物为3,4-二羟基苯乙酸,而其他菌株暂未检出。将各个菌株的发酵产物混合液(Mixture solution of catabolites,MSCs)进行抗氧化能力的测定,发现所有菌株的MSCs的抗氧化能力在原始槲皮素添加量达到1mg/mL的时候达到最高值,并且产气荚膜梭菌(C. perfringens)和脆弱拟杆菌(B. fragilis)的MSCs表现出较高的自由基清除能力,但是对比槲皮素本身的自由基清除能力则有所下降。(3)将各个菌株的MSCs进行癌细胞增殖抑制率的测定,发现产气荚膜梭菌(C.perfringens)和脆弱拟杆菌(B. fragilis)的代谢产物对人结肠癌细胞(HCT-116)产生了较强的增殖抑制作用(P <0.01)且高于槲皮素本身的抑制率;而融合魏斯氏菌(W. confusa)对人肺腺癌细胞株(A549)和人宫颈癌细胞株(HeLa)则比各个菌株MSCs的抑制增殖能力增强(P <0.01)且高于槲皮素本身的抑制率;产气荚膜梭菌(C. perfringens)对HeLa细胞的增殖抑制率稍逊于融合魏斯氏菌(W. confusa)。而其他菌株的MSCs与槲皮素本身相比则具有相似或有所下降的对肿瘤细胞增殖抑制的能力;对于槲皮素和MSCs对五种常见的致病菌种的抑菌作用上,并没有发现明显的抑菌作用。本实验涵盖了较多种的肠道菌株,研究了不同肠道菌株发酵槲皮素后其MSCs的不同生物活性,为进一步研究其他肠道菌株与槲皮素的相互作用提供研究方法,并为槲皮素在人体结肠内的吸收与生物活性的改变将提供重要依据。
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