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4-硝基酚是一类在自然条件中极难降解的芳香族类污染物,严重地抑制生物的生长并威胁人类的健康。然而自然界中存在着一些微生物能够利用这类污染物作为唯一的碳源和氮源来生长,并能将这些污染物完全降解。这些微生物的这一特性使其在污染土壤的生物修复中发挥着重要的作用,因此越来越受到人们的重视,同时针对这些微生物相关代谢途径的研究也成为目前微生物研究中的一个热点。本研究从农药厂废水曝气池中收集活性淤泥作为研究样本,根据已发表的偏苯三酚1,2-双加氧酶及其相关序列设计简并引物,扩增活性污泥样本中偏苯三酚1,2-双加氧酶基因部分片段,克隆获得68条目的基因片段。经序列分析发现共含有12种不同的偏苯三酚1,2-双加氧酶相关的基因序列片段,其中编号T11的片段占所克隆序列总数的比例最高,达55.9%。其与来源于假单胞菌PNP5(Pseudomonas sp. PNP5)的1,2,4-benzenetriol 1,2-dioxygenase氨基酸序列一致性达90%。这些结果表明,该活性污泥中可能含有多种具有降解硝基酚能力的菌。通过富集培养的方法从活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又能有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16SrDNA初步鉴定该菌为假单胞菌的一种,暂定名为假单胞菌1-7(Pseudomonas sp.1-7)。以假单胞菌1-7的基因组DNA为模版,利用之前设计的简并引物扩增该菌的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因的中间片段,再利用TAIL-PCR克隆得到4-NP降解相关基因簇下游的2个基因:偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1和马来酰乙酸还原酶基因mal。通过对偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1的序列分析表明,其与之前克隆获得的T11基因片段的序列一致性达到100%。偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1全长873bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kD。马来酰乙酸还原酶基因mal全长1068bp,(G+C)含量为65.92%,编码355个氨基酸,成熟蛋白理论分子量37.25kD。dio1和mal均已在GenBank中登录,登录号分别为FJ821776和FJ821777。将偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1和马来酰乙酸还原酶基因mal分别克隆入原核表达载体pET-30a,获得重组质粒pET-dio1和pET-mal,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。再将表达产物进行纯化和酶活性测定。其中偏苯三酚1,2-双加氧酶Dio1能够氧化偏苯三酚产生马来酰乙酸,酶活性测定显示偏苯三酚吸收峰从289nm向245nm偏移。而马来酰乙酸还原酶Mal将马来酰乙酸还原为酮己二酸(p-ketoadipate)。马来酰乙酸还原酶Mal的纯化效率为58.9%,纯酶的比活达到193.04U/mg,相比粗酶液比活149.64U/mg有所提高。本研究初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制,为阐明硝基酚的降解途径奠定了基础,同时也为由硝基酚引起的环境问题的生物修复研究提供了理论依据。