组织工程旨在于研究开发替代物并结合人体的再生能力以修复病损组织。生物弹性体能较好模拟人体软组织的力学特征,植入到人体动态的力学环境中能保持结构和力学稳定性,因此在组织工程领域具有巨大的应用前景。近年来,3D(three-dimensional)打印技术因其在宏观形态个性化定制和微观结构精确控制等方面的强大能力,被广泛的应用到再生医学等领域并极大的促进了该领域的创新和发展。然而,如何构模拟天然血管网络,以促进物质交换,让人工组织在体内外能够长期的存活仍然是组织工程的一个关键挑战。另外,可用于3D打印的生物材料很有限,尤其是热固性材料。例如热固性生物弹性体需要在长时间的苛刻条件下才能完成交联,从而无法适用于3D打印这种快速成型方式。此外,如何设计具有个性化结构的管状支架在临床管状组织重建当中也是一个重要问题。但是由于3D打印过程中缺乏支撑作用,导致难以制备有着薄壁多孔结构的大段管状支架。针对上述问题,本课题发展了多种高度通用的新策略,通过挤出式3D打印技术以构建具有多级微孔结构的弹性仿生组织工程支架。主要研究内容如下:(1)本课题第一部分内容主要发展了一种3D打印焦糖化可牺牲模板的方法,以构建可灌注的渗透性多级仿生血管网络(Perfusable and Permeable Hierarchical Microchannel-networks,PHMs)支架。借鉴于中国传统手工艺——糖画的灵感,我们将蔗糖通过一定条件下的焦糖化处理,所获得焦糖墨水可以适用于传统的热塑性加工例如挤出成型。研究了一系列焦糖化处理中(温度和持续时间)和打印过程中(喷嘴尺寸、挤出速率、喷嘴移动速率)的条件,以确保焦糖化墨水具有合适的流变性,从而满足稳定、连续、平滑的打印过程。基于这种3D打印的焦糖模板,我们选用聚己内酯(PCL)作为一种代表性的生物材料开展研究,通过溶液浸渍和模板溶出法来制备PHMs。模板能够被蒸馏水快速溶解除去以形成相互连通的微管道网络。此外,进一步利用人耳数据模型制备了定制的人耳状PHMs。这种方法可以赋予生物材料支架有序的多级结构,从而在多层次模拟天然的血管网络,包括:三维的框架结构、可灌注的微通道网络、渗透性的多孔结构。大量微孔被分布在管道的外表面、内表面以及管壁当中,这些微孔的尺寸均一并且呈正态分布。然后详细地研究了涂层处理中相分离机制的影响因素,包括PCL的不同的分子量、溶液浓度以及所使用溶剂的种类。这种具有可控微孔结构的薄壁管道网络以前很少被报道。值得一提的是,这种PHMs的制备策略具有高度通用性,可以被应用于不同生物材料的加工以制备不同性能的PHMs。作为概念性的验证,我们进一步使用了热塑性的聚氨酯生物弹性体(PCL-PU)和热固性的聚癸二酸甘油酯基聚氨酯(PGSU)生物弹性体作为材料,制备对天然血管网络在结构形态和力学性能上的双效仿生的弹性PHMs。这种方法能够很好地和各种组织工程支架(比如海绵状多孔支架、水凝胶、静电纺纳米纤维支架、细菌纤维素)结合制备含有内嵌仿生血管网络的复合支架。采用水凝胶复合PHMs支架来验证内嵌PHMs的物质运输和交换功能,通过将混有心肌细胞的海藻酸水凝胶对PHMs进行封装以制备三维组织结构。体外实验结果表明,在PHMs的微管道可以提供更好的微环境以维持水凝胶中细胞的生存和活性。此外,在大鼠皮下和心脏外膜植入实验中,与传统的3D打印支架相比,具有特殊结构的PHMs具有更好的组织和血管再生效果。在对心肌梗塞的治疗中,PHMs处理心梗模型后的心肌细胞/成纤维细胞比例显著高于对照组,提示在心梗区域具有更多存活的心肌和减轻的纤维化程度。因此,这种PHMs支架可以作为一种新型的心肌补片而用于心肌梗塞的治疗。(2)本课题第二部分内容,针对热固性材料难以3D打印这个问题,提出了一种新型的通用策略,通过常用的挤出式3D打印机,实现了包括热固性聚酯、聚氨酯和环氧树脂在内多种热固性材料的直接3D打印。该策略的核心将可去除的填充材料与热固性材料预聚物或者前驱体结合为复合打印墨水。作为概念性验证,我们选用代表性的热固性弹性体聚癸二酸甘油酯(PGS)作为打印材料。为了获得稳定的打印性能,对墨水的流变性、挤出性、高温保形性以及微观结构影响,这四个方面进行研究,以获得最优化的打印效果。实验表明墨水中盐颗粒含量的增加会降低流动性,不利于挤出成型,但是会增加高温保形性和结构稳定性,复合比例为1:2是最佳配比,能兼顾流变性、打印稳定性和高温保形性。利用这种方法可以3D打印的PGS支架,具有以往PGS加工方法所难以实现的有序多级结构。其中个性化定制的初级框架结构和图案化排列的二级纤维单元分别可以通过数据建模和打印参数进行控制。更重要的是,第三级结构为在纤维的表面和内部都分布有大量均匀的且相互连通的微孔结构,可大大的提高孔隙率和比表面积,其微孔的尺寸可以通过使用不同尺寸的盐颗粒来进行有效调控。经过3D打印并在盐去除后形成多孔海绵结构。尽管3D打印的PGS支架具有高度的多孔结构,但仍然表现出良好的可拉伸性,优异的弹性和耐疲劳性,在多次形变条件下几乎没有滞后效应,使其能够在体内组织工程应用的动态力学环境中保持原有的多级微孔结构。此外,为了快速观察PGS支架的降解情况,我们采用脂肪酶对其催化降解。3D打印的PGS支架具有良好的体外酶促降解性,在5小时内的降解率为93.5±2.1%。大鼠的皮下移植实验表明,3D打印的PGS支架在逐步降解的同时附近的组织向支架内部生长,同时存在新生的血管并几乎不发生炎症反应。PGS除了良好的生物相容性和生物可降解性之外,其中最重要的优点在于稳定的化学交联结构所赋予的优异弹性,因此在心肌组织工程应用上有着很好的前景。对此,我们进一步3D打印了PGS弹性心肌补片,用于治疗心肌梗塞减轻左心室的重构。在大鼠心梗模型补片处理28天后,H&E和MASSON染色表明PGS弹性补片治疗组可以显著增加左心室的壁厚,减轻左心室的扩张,并降低纤维化程度。(3)本课题第三部分研究采用了4轴打印系统快速地制备了具有多级结构的管状组织工程支架。该方法通过将3D打印机与旋转装置进行协同工作,形成X/Y/Z/Rotation的4轴成型系统。该方法可以适用于非常广泛生物材料例如水凝胶、热塑性生物材料以及热固性生物材料。使用PCL作为代表材料,将PCL熔融挤出呈线条状沉积在接收器的表面,并形成螺旋式排列结构。随着打印的往复进行,纤维周期性的交织在一起,上下层之间交织的纤维之间的连接点通过熔融形成稳定的交织网络,从而使得支架可以保持稳定的管状结构。只需要几分钟就可以加工10厘米以上长度的支架,相比当前管状支架的制备方式,大大的提高的加工效率。基于这种四轴3D打印方法,利用PCL作为打印材料来研究其宏观结构的可控性。仅仅通过使用不同结构的接收轴作为接收装置,可以快速获得一系列形态各异的管状支架。在保证其他打印参数不变的前提下,我们仅仅改变接收的旋转速率,从而获得了不同交织密度的管状支架。通过理论计算和分析,管状支架中纤维的螺距、间距、直径以及交织角度均与接收转速成反比。管状支架的实际各项参数均与理论模型所计算的关系曲线高度匹配,从而展现该方法具有高度的可控性和重现性。虽然PCL为热塑性材料,但管状支架在动态力学应用中表现出良好的弹性和耐疲劳性。此外,支架的力学性能还可以通过对交织网络的设计来进行调控。将这种4轴打印技术与第(2)部分中的热固性材料打印方法相结合,制备了PGS生物弹簧。这种生物弹簧展现出良好的柔性和弹性,以及有序的多级结构。为了展现四轴3D打印的初步应用,进一步在PGS生物弹簧的外表面通过静电纺丝技术制备了明胶纳米纤维外层,以构建了PGS/明胶杂化管状支架。然后通过体内外实验开展这种杂化管状支架在气管软骨中的组织工程应用。体外细胞培养中,PGS/明胶双层杂化管状支架具有良好的生物相容性,软骨细胞在支架上表现出良好的生长和增殖情况。体外培养8周后,杂化管状支架生长出明显的凝胶状软骨组织。免疫组化可以看出大量的软骨细胞在支架表面生长、增殖,并分泌出大量软骨组织的细胞外基质,形成密实的管状软骨。进一步在裸鼠皮下植入12周后,杂化管状支架形成了具有力学强度和弹性的成熟管状软骨。这种人工管状软骨的湿重、壁厚以及DNA含量略高于天然的气管软骨。此外,其杨氏模量、糖胺聚糖(GAG)以及胶原总含量可以达到正常气管软骨的70%以上。综上所述,本论文针对当前难以构造人造血管网络、可3D打印的生物材料有限、管状生物支架的制备困难等问题。基于3D打印技术,设计并提出了三种新策略和方法以构建一系列的弹性仿生组织工程支架,例如可灌注的渗透性多级仿生血管网络支架、热固性PGS多孔支架以及形态结构可控的管状支架。这些支架在相关的组织工程中均展现出良好的应用效果。支架可作为心肌补片用于治疗心肌梗塞,能有效防止左心室扩张、增厚心肌、促进血管再生、减少纤维化;而管状支架可实现大段成熟管状软骨的再生,具有和天然气管软骨相似的性能。基于以上策略的良好的通用性,可以将不同生物材料加工成具有有序多级结构的个性化支架,有望进一步拓展例如骨、神经和血管等其他组织的生物医学应用。