植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸反应体系的研究

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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是亚油酸(Linoleic Acid, LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中,c9, t11-CLA被认为最具生物活性。由于乳酸菌生物转化共轭亚油酸具有安全性高、专一性强等优点,目前已经成为合成共轭亚油酸的研究热点。本文通过结合气相色谱法(GC)、银离子高效液相色谱法(Ag+-HPLC)和气质联用法(GC-MS)三种检测方法,确定了植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的产物主要有c9, t11-CLA、t10, c12-CLA及t, t-CLA,并选择气相色谱法作为本课题的定量检测方法。通过比较植物乳杆菌ZS2058完整细胞在有机介质、微水介质、两相介质和水介质中生物转化CLA的产量,确定最适合植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的反应介质为水介质。在1mL磷酸钾缓冲溶液反应体系中,通过单因数实验和响应面分析,确定了最合适的反应条件为:底物浓度为0.8 mg/mL,细胞浓度为4×1010 cfu/mL,反应温度为37℃,缓冲液pH值为6.5。在此反应条件下,c9, t11-CLA的浓度为374μg/mL,转化率高达46.75%。在此基础上,本论文探讨了底物浓度、细胞浓度、反应体系pH值、反应温度等因素对植物乳杆菌ZS2058完整细胞生物转化CLA的反应速度的影响。实验结果表明存在明显的底物抑制现象,当LA浓度达到0.4 mg/mL时,产生c9, t11-CLA的反应速度达到最大值,为15.99μg/(mL?h);反应速度随着细胞浓度增加而上升,当细胞浓度达到5×1010 cfu/mL时,反应速度达到最高;生物转化CLA的最适pH值和最适温度分别为6.5和40℃。同时利用双倒数作图法和Hanes-Woolf作图法求得米氏常数,并建立了反应初始阶段不同底物浓度范围内的速度方程。在低底物浓度下,反应规律与酶学上经典的米氏方程相符合,米氏常数为:Vmax:21.74μg/(mL·h);Km:0.16 mg/mL。在高底物浓度下,存在明显的底物抑制现象,但反应速度方程与经典的底物抑制速度方程存在差异。最后对所建立的速度方程进行了验证。
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