阿尔茨海默症（AD）作为一种目前无法预防、治愈甚至减缓的神经退行性疾病,日渐成为常见的威胁人类生命健康的重大疾病。早期AD患者脑部组织中多种金属离子代谢平衡发生紊乱,引发大量活性氧（ROS）,进而引起过度磷酸化tau（p-tau）蛋白的产生,导致神经元死亡;同时提升β-分泌酶（β-Secretase,BACE1）的活性和表达量,BACE1切割淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）促使脑组织中β淀粉样蛋白（Aβ）的累积,造成脑组织病变。实现AD早期相关物质的准确监测,全面地从分子机制上将AD发生、发展过程研究透彻,对精准预防、治疗AD具有重要意义。目前已报道多种检测方法用于AD发病过程相关活性物质的分析,其中荧光分析法因具有实现生物样品中目标分析物动态可视化成像检测的优势,广泛应用于生物识别、生物检测、生物医学等领域。但是,实现AD重要病理相关活性物质的高选择性、高灵敏度、准确快速的荧光成像检测仍存在很大的挑战:1、生物样品的成分相对复杂,共存活性物质种类繁多,且浓度较低,需要发展选择性好、检测限低的探针。2、为了深入了解各组分之间复杂的相互作用,全面掌握AD病理过程,需要发展多组分活性物种同时检测的荧光探针,为揭示重要的代谢过程、信号通路提供有效的方法。3、活体组织微环境处于动态多变状态,易干扰探针荧光强度,需要发展荧光寿命探针和比率荧光探针,提高探针的准确度,规避环境因素对检测结果的影响。针对目前存在的科学问题,为实现准确监测AD病理代谢过程中相关活性物质的变化,本论文开展了以下三方面研究内容:1、设计并组装了同时检测AD鼠脑中Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的新型框架核酸纳米荧光寿命探针τ-metal。探针主体框架为边长约12 nm的DNA四面体,在四面体的三个顶点处分别组装了特异性检测Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的金属离子DNAzyme,三种DNAzyme结构中分别包含三种同一激发、不同发射的荧光团以及对应的淬灭剂。当目标离子存在时,DNAzyme基底链被切断,带有荧光团淬灭剂的DNA链离去,致使探针τ-metal在相应波段的荧光寿命发生变化,从而实现对目标离子的检测。可将探针τ-metal用于鼠脑皮层、纹状体以及海马区域神经元细胞质中Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺的荧光寿命成像和生物传感。2、设计并合成了首个荧光寿命探针τ-p-tau用于高选择性地检测单个神经元内的p-tau蛋白。探针结构中包含两个识别基团Zn-Dpa,可以结合p-tau蛋白表面特定间距的磷酸根,荧光团为改进后拥有大Stokes-shift（160 nm）的花菁类衍生物荧光团。该探针首次通过荧光寿命的变化来监测p-tau蛋白的浓度变化,线性范围是1.0-5.0μM,响应时间6.2 s,可用于单个神经元内p-tau蛋白的荧光寿命成像和生物传感。3、设计并合成了首个双光子比率型荧光探针AF633mCyd用于AD鼠脑中BACE1的检测。探针结构中有一段可以被BACE1特异性水解切割的小肽,长度小于10nm,用作识别基团;肽链的两端分别连接能量供体双光子部花菁衍生物荧光团mCyd和能量受体荧光团Alexa Fluor 633（AF633）,形成荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）体系。该探针被BACE1特异性切割后,供体mCyd的荧光强度恢复,受体AF633的荧光强度减弱,从而达到比率荧光检测BACE1的目的。探针AF633mCyd是首次报道的BACE1双光子比率型荧光探针,具有好的组织穿透性、低的生物背景荧光、抗环境因素干扰等优势。将探针用于正常鼠脑和AD鼠脑皮层、纹状、丘脑、海马区域的BACE1的比率荧光成像和生物传感检测,结果发现与正常鼠脑相比,AD鼠脑中的BACE1水平升高,其中皮层和海马区域的升高尤为明显。同时也用ROS试剂盒检测了正常鼠脑和AD鼠脑的皮层、纹状、丘脑、海马区域的ROS含量,结果显示与正常鼠脑相比,AD鼠脑中的ROS水平升高,其中皮层和海马区域的升高尤为明显。这项研究表明,ROS、BACE1以及AD三者之间有着密切的联系。