论文部分内容阅读
目的1.以丝素蛋白(Slik Fibroin,SF)/羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)为材料,制备含软骨钙化层(Calcified cartilage layer,CCL)的仿生骨软骨支架,与不含CCL的骨软骨支架进行比较,评估其结构和理化性能,观察两种支架在软骨层和成骨层交接部位的形态差别。2.分离培养兔脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs),并进行相关鉴定,评估含CCL的仿生骨软骨支架生物相容性,验证CCL作为软骨层和成骨层界面结构的隔离作用,为建立软骨和骨不同的生长微环境提供基础。3.支架软骨层和骨层复合ADSCs体外骨软骨诱导分化研究,探讨其作为骨软骨支架的可行性。4.观察含CCL的仿生骨软骨支架复合ADSCs对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响,验证CCL和ADSCs在体内修复中起到的作用,探讨这一设计组合作为骨软骨组织工程理念的可行性。方法1.以SF/HA为材料,采用石蜡微球沥滤和定向结晶TIPS技术相结合的方式,制备一种具有创新性的含软骨钙化层的多相一体化仿生支架,通过体式显微镜、扫描电镜、micro-CT、X衍射和傅里叶红外光谱仪进行观察其结构特征,测定支架软骨层和成骨层的孔径、孔隙率、吸水率和压缩弹性模量。2.分离、培养及鉴定兔ADSCs,将第3代ADSCs接种到支架上,通过扫描电镜观察、Dead/Live染色、CCK8检测和组织学染色观察细胞在支架上的黏附、活性和增殖能力,采用Di O/Di I两种不同颜色的细胞荧光标记技术,验证CCL作为软骨层和成骨层界面结构的隔离作用。3.将第3代ADSCs接种到分离开的支架软骨层和成骨层上,分别给予特定的成软骨和成骨诱导培养。软骨层行蛋白多糖和II型胶原组织学、免疫组化染色及生化定量分析,PCR检测II型胶原、蛋白多糖和SOX9表达变化;成骨层钙结节和I型胶原组织学、免疫组化染色以及生化定量分析,检测I型胶原、骨连蛋白和骨桥蛋白表达变化。检测随诱导时间延长支架压缩弹性模量的变化。4.建立兔双侧膝关节骨软骨缺损模型,分别植入CCL组、Non-CCL+ADSCs组和CCL+ADSCs组,分别在术后4w、8w和12w时取材,进行大体观察评分、组织学和免疫组化评估、新生骨软骨组织的生化定量检测、新生骨组织Micro-CT扫描与评估及生物力学测试,评估两组兔膝关节骨软骨缺损修复效果,对比分析CCL和ADSCs在体内修复中起到的作用。结果1.含CCL的仿生骨软骨支架由层次鲜明的“透明软骨-CCL-软骨下骨”3部分组成,各层连接紧密。软骨层具有明显的取向微孔结构,分布均匀,孔径112.43±12.65μm,孔隙率高达90.25%±2.05%;成骨层三维大孔结构,连通性好,孔径362.23±26.52μm,孔隙率85.30%±1.80%。经压缩模量测试,支架软骨层的弹性模量为52.48±5.78k Pa,成骨层的弹性模量为54.93±5.44k Pa。2.ADSCs体外培养呈长梭形,接种到支架上,扫描电镜、Dead/Live染色CCK8和组织学结果显示细胞在支架上良好的黏附增殖活性,说明该支架具有良好的生物相容性。CCL有效地隔离了软骨层和成骨层间细胞的迁移混合,为建立软骨和骨不同的生长微环境提供基础。.3.经对应的诱导培养后,在软骨层上蛋白多糖和II型胶原含量升高,II型胶原、蛋白多糖和SOX9的表达水平出现明显的上调;成骨层I型胶原、骨连蛋白和骨桥蛋白表达水平、骨基质(钙和I型胶原)随诱导时间延长而增长。软骨层和成骨层的压缩弹性模量均出现明显提高。4.CCL+ADSCs组软骨再生情况较CCL组和Non-CCL+ADSCs组更好,主要体现在软骨表面平整度和完整度;CCL+ADSCs组新生软骨组织中GAG和II型胶原含量高于CCL组和Non-CCL+ADSCs组;CCL+ADSCs组深层新生骨组织分析、生物力学性能测试优于CCL组,与Non-CCL+ADSCs组无明显差异。结论含CCL的SF/HA仿生骨软骨支架模仿正常骨软骨组织的结构,具有良好的三维孔隙结构和生物相容性。CCL隔离软骨层和骨层,为成软骨和成骨分化提供差异微环境,支架各层均能够支持ADSCs进行对应的诱导分化。该支架复合自体来源的ADSCs有利于兔膝关节骨软骨缺损的修复,CCL的存在加速软骨组织的生长,ADSCs能够促进软骨和骨组织的生成。这一理念的验证为今后的骨软骨组织工程临床应用提供一定的可行性方案。