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肝癌是全球第六位常见恶性肿瘤，该疾病不仅具有高致死率，近年来发病率也呈上升趋势，对肝癌的预防和治疗及其机理研究一直是各国科学家探索的焦点。现在广泛使用的治疗手段如外科切除术、肝移植等虽然对肝癌的治疗有一些效果，但这些治疗方法存在一些限制，如对患者创伤巨大、可能导致免疫紊乱、适用人群少等。 近年来研究发现间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有向损伤组织或肿瘤细胞靶向迁移的能力，这一特性吸引了众多学者的关注。MSCs不仅具有增殖能力较强、免疫相容性良好、来源广泛和不涉及伦理问题等基本特征，而且具有靶向迁移的特性。因此，MSCs极可能发展成为一种具有靶向治疗肿瘤细胞能力的抗瘤工具。 MSCs的自我更新和分化潜能等生物学行为高度依赖于所处的微环境。MSCs迁移到肿瘤细胞后会参与重塑肿瘤微环境进而影响到肿瘤细胞的生物学行为，该微环境也能反馈调节MSCs的生物学特性。微环境的扰动可能导致MSCs过度增殖或恶性生长，甚至还可能发生癌变。但在该过程中，肿瘤细胞与MSCs相互作用的机制并不清楚，MSCs在重塑微环境中的生物学行为变化受到哪些受体或信号调控及其机制也鲜有研究。因此，本文旨在探索 MSCs在肿瘤微环境作用下生物学行为的变化，并对其相关分子机制进行探讨。该研究工作的主要内容和结果如下： 1.大鼠MSCs（rat MSCs，rMSCs）的原代分离培养 通过淋巴细胞分离液（Percoll）密度梯度离心法结合差时贴壁法分离rMSCs。结果显示，从大鼠骨髓腔分离得到的rMSCs体外培养24h即可贴壁，7天左右长出漩涡状集落，记为P0代。传代一次后记为P1代，以此类推。此法分离得到的rMSCs具有漩涡状分布特征，细胞形态呈梭型并趋于一致。该细胞在生长过程中能完全铺展，无叠层生长现象。通过流式细胞术进一步检测了细胞周期分布情况，结果显示G0/G1期细胞为94.23±0.84％，G2/M期细胞为4.44±1.13%，S期细胞为1.34±0.30%，说明大部分细胞处于静止期，符合干细胞周期分布的基本特征。 2.大鼠肝癌细胞条件培养基通过SDF-1/CXCR4-ERK1/2信号促rMSCs迁移 通过Transwell法体外检测了大鼠肝癌细胞条件培养基（Conditioned medium from hepatocellular carcinoma cells，HCC-CM）对rMSCs迁移的影响。结果显示，HCC-CM显著促进 rMSCs迁移，而大鼠正常肝细胞条件培养基（Conditioned medium from rat normal hepatocyte cells,NCM）则对rMSCs的迁移行为没有明显影响；HCC-CM促rMSCs迁移的过程中伴随着rMSCs SDF-1基因及其受体CXCR4基因的表达上调，Western blot进一步证实了rMSCs CXCR4蛋白水平表达的上调（p<0.05）。rMSCs在HCC-CM刺激下，从15min至2h均出现ERK1/2磷酸化显著上调，且在15 min时达到峰值（p<0.01），之后略有下降，但均显著高于对照组。MEK/ERK1/2抑制剂PD98059消除了HCC-CM对ERK1/2的激活，同时完全阻断了HCC-CM促rMSCs的迁移，表明ERK1/2信号分子介导了HCC-CM促rMSCs迁移。CXCR4抑制剂AMD3100显著抑制HCC-CM诱导的ERK1/2磷酸化，同时抑制HCC-CM促rMSCs迁移。这些结果提示，HCC-CM促进rMSCs迁移可能是通过SDF-1/CXCR4-ERK1/2信号通路实现的。 3. HCC-CM促进rMSCs增殖及其分子机理 本文通过MTT法、EdU细胞增殖检测和细胞周期检测等方法考察了HCC-CM对rMSCs增殖的作用。结果显示，HCC-CM明显促进了rMSCs增殖，同时发现NCM也能促进rMSCs增殖，但不及HCC-CM作用显著。Western blot检测发现，HCC-CM在15min至2 h均能使rMSCs ERK1/2磷酸化显著上调，15min时与对照组比较即有显著性差异（p<0.01），之后略有下降，但均显著高于对照组。PD98059可完全消除HCC-CM诱导的ERK1/2磷酸化并同时阻断HCC-CM诱导的rMSCs增殖，提示ERK1/2是HCC-CM促rMSCs增殖的主要信号介导分子。本文发现，HCC-CM促rMSCs增殖过程中SDF-1基因表达上调，但CXCR4在mRNA水平和蛋白水平的表达与对照组无明显差异。尽管如此，CXCR4抑制剂AMD3100部分抑制ERK1/2磷酸化，并部分抑制了HCC-CM促rMSCs增殖。这些结果表明HCC-CM促进rMSCs增殖是通过ERK1/2信号通路完成的，且该信号受到CXCR4的部分调控。我们还对细胞核内与增殖密切相关的NF-κB信号进行了初探，结果显示NF-κB抑制剂PDTC显著抑制HCC-CM诱导的rMSCs增殖行为，提示NF-κB可能是参与HCC-CM促增殖行为的核内信号分子。 本文的研究结果表明，HCC-CM显著促进rMSCs的迁移和增殖，这个过程可能受到SDF-1/CXCR4的调控，ERK1/2是参与整个过程的关键信号分子。