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目的:全世界每年因细菌感染死亡的人数大约有1600万,而其中70%以上的难愈性慢性感染与细菌形成生物膜导致的耐药有关。生物膜是微生物分泌至胞外的多聚基质粘附于介质表面形成的用于将其自身包裹于内的膜样结构。细菌形成生物膜后,可通过限制药物渗透使药物在生物膜内无法达到有效抑菌浓度,或是通过影响生物膜内pH值从而影响药物的解离度等机制降低抗生素的抑菌效能,明显增强细菌的耐药性,导致细菌耐药性及慢性感染。因此,抑制细菌生物膜形成,降低细菌耐药性,提升抗生素的抑菌效能,有望缓解细菌耐药及难愈性慢性感染问题。但目前尚无生物膜抑制剂成功应用于临床,急需发展新型生物膜抑制剂。本论文主要是通过对本课题组设计合成的不同骨架类型的化合物进行筛选,以期发现新型有效的生物膜抑制剂,并对活性化合物的抗生物膜机制进行探究,最终获得机制明确、安全有效的新型铜绿假单胞菌生物膜抑制先导化合物。方法:1、实验菌株:铜绿假单胞菌是临床上最常见的易形成生物膜耐药的条件致病菌,因此选用铜绿假单胞菌标准菌株PAO1(ATCC 15692)作为模式菌株,进行生物膜抑制剂的筛选。2、活性筛选:(1)结晶紫染色法(定化合物浓度):采用96孔板结晶紫染色定量法,对本实验室设计合成的小檗碱衍生物、木豆素类似物、以及吡喃酮类等多类不同结构骨架的化合物进行铜绿假单胞菌生物膜抑制活性的定量初筛。(2)最低抑菌浓度(MIC):采用96孔板倍半稀释法检测筛选已得到的具有生物膜抑制活性化合物的最低抑菌浓度(MIC),判断活性化合物在生物膜抑制的有效浓度范围内是否影响细菌生长,获得在生物膜抑制有效浓度范围内对细菌生长无影响的生物膜抑制苗头化合物。(3)激光共聚焦显微拍照(Confocal)法:采用Confocal拍照进一步确证抗生物膜先导化合物对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制及生物膜形态影响的效果。(4)浓度依赖性实验:采用结晶紫染色法检测不同浓度苗头化合物对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制效果,进一步系统研究苗头化合物的生物膜抑制作用,以及通过抑制活性是否具有浓度依赖性以判断化合物对细菌生物膜的抑制作用是否具有靶向特异性。3、机制研究:(1)毒力因子检测:通过检测先导化合物对分别受Las、Rhl、PQS群体感应系统(QS)调控的毒力因子如弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素等产生量的影响,推测化合物可能的作用通路。(2)荧光报告菌株:利用PAO1-lasB-gfp、PAO1-rhlA-gfp和PAO1-pqsA-gfp等调控生物膜形成不同通路对应的荧光报告菌株在分子水平上进一步验证抗生物膜先导化合物的生物膜抑制通路。(3)利用计算机分子对接,模拟苗头化合物和相应通路调控蛋白的相互作用,进一步探索化合物是否通过同细菌自身分泌的信号分子竞争性抑制靶调控蛋白,实现对生物膜形成的调控。4、安全性评价:采用MTT法检测苗头化合物对哺乳动物(小鼠巨噬细胞RAW264.7)活力的影响,评价化合物的安全性。结果:1、生物膜抑制活性初筛结果:(1)通过结晶紫染色法初筛发现新型吡喃酮类化合物具有良好的生物膜抑制活性,其中化合物6a生物膜抑制活性最好,在筛选浓度(20μM)6a的生物膜抑制率为50.98±1.97%。(2)96孔板倍半稀释法检测发现新型吡喃酮类化合物的最低抑菌浓度(MIC均大于512μM),证明此类化合物在其生物膜抑制有效浓度范围内均对细菌的生长无影响。(3)Confocal拍照进一步确证了抗生物膜先导化合物6a对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制及对生物膜形态的影响效果。(4)生物膜抑制浓度梯度实验确证了不同浓度的先导化合物6a对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制效果具有浓度依赖性,提示其对细菌生物膜为靶向特异性抑制作用。2、机制研究结果:(1)对分别受Las、Rhl、PQS群体感应系统(QS)调控的毒力因子如弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素的检测结果显示,化合物6a可特异性抑制绿脓素分泌,推测化合物6a可能是通过特异性作用于PQS群体感应通路发挥生物膜抑制作用。(2)进一步的荧光报告菌株PAO1-lasB-gfp,PAO1-rhlA-gfp,PAO1-pqsA-gfp结果显示,化合物6a同样只对PAO1-pqsA-gfp报告菌株的GFP荧光蛋白表达有显著影响,进一步从分子水平上确证了化合物6a的作用机制是特异性的作用于PQS通路。(3)计算机对接分析显示化合物6a与PQS通路的重要转录调控受体蛋白PqsR具有良好的结合,对接分数为6.7014,该对接分数甚至高于内源性信号分子PQS,这一结果揭示化合物6a很可能是通过与PQS信号分子竞争,特异性地与PqsR受体蛋白结合,从而抑制PQS群体感应通路,最终抑制生物膜的产生。3、安全性评价结果:细胞毒实验结果显示化合物6a作为生物膜抑制剂在生物膜抑制有效浓度范围内对哺乳动物细胞没有毒性。结论:通过对本课题组设计合成的不同骨架类型的系列化合物进行生物膜抑制活性筛选,发现了一类低毒、高效的新型吡喃酮类生物膜抑制剂。并进一步通过对此类活性最好的化合物6a的机制研究,阐明了此类化合物主要是通过竞争性地抑制PqsR受体,从而特异性的抑制PQS群体感应通路,最终实现抑制毒力因子绿脓素的分泌和铜绿假单胞菌生物膜的形成。此类PQS特异性靶向生物膜抑制剂的发现,为开发靶向生物膜抑制剂,用于临床慢性感染性疾病的治疗提供了新的候选先导物。