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目的:细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTL细胞)是一类具有CD8+表面标志、受MHC I类分子限制性杀伤功能的T淋巴细胞,其重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞,在肿瘤免疫中,体内杀伤肿瘤的最终效应细胞CD8+T淋巴细胞,但其杀伤肿瘤的能力经常被肿瘤分泌的免疫抑制因子所抑制,如转化生长因子-β(TGF-β)。在本研究中,我们应用TGF-β不敏感的CD8+T淋巴细胞过继性输注至肾癌个体化荷瘤免疫重建重度免疫缺陷(SCID)鼠体内,来评价其对肾癌的治疗效果。我们应用肿瘤裂解物负载的人树突状(DC)细胞,与CD8+T淋巴细胞共培养以激发其杀伤活性,用包含显性负相II型TGF-β受体(TβRIIDN)基因的逆转录病毒感染CD8+T淋巴细胞,使其对TGF-β信号通路不敏感。检测转染后CD8+T淋巴细胞表型变化及体外杀伤作用,将这种TGF-β不敏感的CD8+T淋巴细胞过继性输注至免疫重建后的个体化肾癌荷瘤SCID鼠体内,评价其抗肿瘤免疫治疗作用及机制。方法:1)构建含有显性负相TGF-βII型受体(TβRIIDN)质粒的逆转录病毒:含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒转染293包装细胞,32℃下共转染12小时,10% DMEM培养基37℃下孵化过夜,PBS漂洗后同样条件再次转染293细胞24小时,收集上清,获得含有TβRIIDN重组逆转录病毒。2)人肾癌原代细胞系的建立:无菌条件下将新鲜切取的肾癌组织剪成1.0cm3小块,包埋于裸鼠双侧腋下,4周后肿瘤组织生长至2-3cm3大小时,连续传代3次以上后取组织块培养,用胶原酶II及胰酶消化,得到上皮样肿瘤细胞,连续传代50次以上,得到稳定传代的肾癌原代细胞系。3)SCID-beige鼠免疫重建(Hu-PBMC-SCID):取患者外周血5-10ml,用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC),用PBS重悬成0.3ml细胞悬液,腹腔注射至6-8周龄SCID-beige鼠体内,注射前SCID鼠接受剂量为3.5 Gy的钴60照射,4周后尾静脉取血,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中人IgG含量。4)检测肾癌组织及肾癌原代细胞系中TGF-β1表达:用免疫组织化学及免疫荧光方法检测肾癌手术标本、裸鼠成瘤组织以及肾癌细胞系中TGF-β1表达。5)肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞的分离培养与激活:取肾癌患者外周血,分离获得PBMC细胞,加入含rhIL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)的完全培养基,隔日半量换液,在第6d梯度离心收获非粘附细胞为非成熟的DC细胞。反复冻融法获得肾癌细胞裂解物,裂解物反复刺激冲击非成熟的DC细胞,同时用免疫磁珠法分离外周血获取CD8+T淋巴细胞,将负载肾癌抗原的DC细胞与CD8+T淋巴细胞,同时加入rhIL-2(500U/ml)共培养,获得肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞。6)肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞转染:获取TGF-β不敏感CD8+T细胞(TβRIIDN CD8+T细胞):含有TβRIIDN和GFP基因重组逆转录病毒转染负载肾癌抗原的CD8+T细胞5%CO2、37℃下孵化48小时,获得表达TGF-β不敏感CD8+T细胞,流式细胞仪检测CD8+T淋巴细胞表型CD27,CD45RA表达。7)TβRIIDN- CD8+T淋巴细胞体外杀伤实验:将未经活化的CD8+T淋巴细胞(na?ve CD8+T淋巴细胞)以及TβRIIDN CD8+T淋巴细胞与相关肾癌细胞系共培养,51Cr释放实验测定其细胞杀伤作用,人前列腺癌细胞系PC-3作为对照靶细胞。8)TβRIIDN- CD8+T淋巴细胞体内抗肿瘤评价:建立肾癌细胞系皮下荷瘤免疫重建SCID-beige鼠模型,免疫重建SCID-beige鼠15只,随机分为3组,每组5只,皮下注射肾癌细胞5×106个,注射14天后肿瘤长至2-3mm时,分别腹腔注射TβRIIDN- CD8+T细胞(1×107),na?ve CD8+T细胞(1×107),以及PBS(0.5ml),一周后重复注射一次;同时建立肺转移Hu-PBMC-SCID鼠模型,Hu-PBMC-SCID 15只,随机分为3组,每组5只,分别尾静脉注射肾癌细胞5×106个,于注射后第7天分别腹腔注射TβRIIDN- CD8+T细胞(1×107),na?ve CD8+T细胞(1×107),以及PBS(0.5ml),一周后重复注射一次,观察至第40天各组荷瘤小鼠的肿瘤体积,重量的改变及生存情况,同时用TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况。9)小鼠体内细胞因子检测:尾静脉取小鼠血清行酶联免疫吸附(ELISA)测定细胞因子IFN-γ变化情况。10)肿瘤组织凋亡检测:取肿瘤组织,用原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤凋亡结果:1)建立了5例肾癌原代细胞系:共取68例肾癌手术标本接种裸鼠,5例肿瘤标本在裸鼠体内生长并可在体外稳定传代超过100次,手术接种成功率7.3 %。2)肾癌组织及细胞系中TGF-β1表达:TGF-β1在肾癌组织及细胞系的胞浆及细胞膜中呈强表达。3)Hu-PBMC-SCID鼠血清中人免疫球蛋白(IgG)的含量:110只用患者PBMC进行免疫重建的SCID-beige鼠中,75只可以检测到IgG表达,免疫重建成功率68.2%,IgG表达水平在0.8-2.2mg/ml之间,各组表达水平无明显统计学差异(P>0.05)。4)流式细胞仪分析:免疫磁珠分离CD8+T淋巴细胞纯度为98%。对GFP荧光分析提示TβRIIDN和GFP的逆转录病毒转染效率分别为92.13%和91.95%。对两种CD8+T淋巴细胞表型分子CD27,CD45RA的分析提示TβRIIDN CD8+T细胞优势表达CD27+CD45RA-(78.6±6.7%),为效应性T细胞表型,而na?ve CD8+T细胞优势表达CD27+CD45RA+(60.5±16.2%),为未活化T细胞表型。5)51Cr释放实验测定显示TβRIIDN CD8+T淋巴细胞对肾癌细胞杀伤活性较na?veCD8+T细胞强,在E:T为100:1时,其杀伤活性为75.5%,而na?veCD8+T细胞仅为15.8%。两种CD8+T淋巴细胞对人前列腺癌细胞PC-3无明显杀伤作用,结果表明阻断的TGF-β信号通路能增加CD8+T细胞肿瘤特异性杀伤活性。6)在成功构建的皮下荷瘤的SCID鼠模型分别接种两种CD8+T细胞,TβRIIDN CD8+T细胞治疗组肿瘤组织重量和体积均较na?veCD8+T细胞治疗组有明显差异(p<0.001),而在小鼠肺转移模型中,TβRIIDN CD8+T细胞治疗组其肺转移灶明显少于na?veCD8+T细胞治疗组,其生存期也明显延长(p<0.05)。TUNEL检测发现TβRIIDN CD8+T细胞治疗组多数肿瘤细胞发生凋亡,而na?veCD8+T细胞治疗组并未发现明显凋亡。这些结果说明TGF-β不敏感的CD8+T细胞可以发挥其特异性抗肿瘤活性,提高肾癌皮下荷瘤及肺转移小鼠的生存率,降低肺转移率。7)接种两种CD8+T细胞的荷瘤小鼠体内可以测出IFN-γ基础水平,接种TβRIIDN CD8+T细胞其荷瘤小鼠体内IFN-γ水平升高更为明显(P<0.05)。结论:1)成功构建了含有TβRIIDN质粒的逆转录病毒;2)成功建立了5例肾癌原代细胞系,发现肾癌中存在有TGF-β1高表达。3)成功用患者外周血单核细胞(PBMC)对SCID-beige鼠进行人免疫系统重建,并可检测到人IgG表达。4)用肾癌细胞裂解产物作为抗原负载DC,与CD8+T淋巴细胞共培养,诱导出了肾癌特异性的CD8+T淋巴细胞;5)使用修饰后TβRII基因转染肾癌特异性的CD8+T淋巴细胞,使TβRII显性负相表达,阻断TGF-β信号通路;6)TβRIIDN CD8+T淋巴细胞呈效应性T细胞表型;7)TGF-β不敏感的CD8+T淋巴细胞能明显抑制肾癌皮下荷瘤小鼠肿瘤生长,并提高肺转移小鼠的生存率,诱导肿瘤凋亡。8)TGF-β不敏感的CD8+T淋巴细胞具有肿瘤特异性杀伤靶细胞作用。9) TGF-β不敏感的CD8+T淋巴细胞输注的荷瘤小鼠体内IFN-γ水平明显升高。