第一部分OPG对人主动脉平滑肌细胞表达炎症因子的影响目的：炎症反应贯穿于腹主动脉瘤(AAA)发生发展的全过程,单核/巨噬细胞浸润是AAA形成过程中重要的病理特征之一。在本研究中,我们通过观察OPG对TNF-α诱导下血管平滑肌细胞表达炎症因子的影响,探讨OPG在炎症细胞浸润及AAA形成过程中的作用及机制。方法：体外培养人主动脉平滑肌细胞(HVSMC)。实验对象随机分为4组：①正常对照组；TNF-α(5ng/ml)处理组；③OPG(5ng/m1)处理组;TNF-α(5ng/ml)+OPG (5ng/ml)处理组。在刺激6h、12h、24h后,应用ELISA法和RT-PCR技术检测各组细胞中单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)的表达情况。结果：TNF-α(5ng/ml)处理组的MCP-1、VCAM-1的表达量明显高于正常对照组、OPG (5ng/ml)处理组、及1TNF-α(5ng/ml) +OPG (5ng/ml)处理组,并有时间依赖性。TNF-α(5ng/ml)+OPG(5ng/m1)处理组中MCP-1及VCAM-1的表达量较TNF-α处理组明显降低,而5ng/ml OPG对HVSMC的MCP-1及VCAM-1表达均无明显影响。结论：在AAA的发生发展过程中,TNF-α-作为一个有效促炎症因子发挥作用。OPG通过抑制TNF-α的促炎效应,可在一定程度上减轻炎症对血管平滑肌细胞的刺激,从而起到血管保护作用。第二部分OPG对人主动脉平滑肌细胞的抗凋亡作用目的：主动脉正常生理功能的维持依赖于相对稳定数量的血管平滑肌细胞。AAA以中膜破坏为主要特征,血管平滑肌细胞的过度凋亡是主动脉壁结构受损的主要原因。在本研究中,我们通过观察OPG对TNF-α诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响,探讨OPG在细胞凋亡及AAA形成过程中的作用及机制。方法：体外培养人主动脉平滑肌细胞(HVSMC)。实验对象随机分为4组：①正常对照组；②TNF-α(5ng/m1)处理组；③OPG(5ng/m1)处理组;④TNF-α(5ng/ml)+OPG (5ng/ml)处理组。在刺激6h、12h、24h后,采用TUNEL发检测细胞凋亡情况。结果：TNF-α(5ng/ml)处理组的凋亡指数明显高于正常对照组、OPG(5ng/m1)处理组、及TNF-α(5ng/ml)+OPG (5ng/ml)处理组(P<0.01)。OPG(5ng/m1)单独作用未能诱导HVSMC凋亡,而TNF-α+OPG处理组的凋亡指数与TNF-α处理组比明显降低,有显著性差异(P<0.01)。结论：促炎因子TNF-α可以诱导人主动脉平滑肌细胞凋亡。OPG可一定程度上抑制TNF-α的促HVSMC凋亡的效应,提示OPG可通过抑制炎症反应对血管平滑肌细胞凋亡的刺激,从而避免动脉中层结构过度破坏所致的AAA形成。第三部分OPG蛋白表达下调对TNF-a诱导的人主动脉平滑肌细胞炎性特征的影响目的：核转录因子(NF-κB)是细胞内炎症反应重要的转录调控因子。NF-κB与炎症反应、免疫应答及细胞的增生、转化、迁徙、凋亡等多种病理生理过程有密切联系。在本研究中,我们通过RNA干扰(RNAi)技术下调OPG蛋白表达,观察OPG下调对TNF-α诱导的HVSMC炎性特征产物NF-KB的影响,探讨OPG在AAA发生、发展过程中的作用及机制。方法：原代培养的HVSMC转染OPG-shRNA干扰质粒,应用RT-PCR法检测OPG mRNA以明确干扰效率。构建并包装重组腺病毒载体pAd-OPG-shRNA,将其转染到体外培养]HVSMC后,分别以TNF-α(5ng/ml)或TNF-α(5ng/ml)+OPG (5ng/ml)刺激各组细胞诱导HVSMC炎症激活。用免疫印记法检测各组细胞核内NF-κBp65表达情况。结果：从pYr-1.1-OPG-shRNA质粒中扩增得到OPG-shRNA基因片段,酶切电泳及质粒测序结果显示OPG-shRNA序列成功插入目的载体且序列正确。OPG-shRNA质粒转染HVSMC有效干扰该细胞OPG的表达。将此OPG-shRNA基因重组到腺病毒载体中,获得高滴度(109pfu/m1)、高纯度的腺病毒颗粒。Western blotting检测结果显示：TNF-a(5ng/m1)处理24h后,转染组细胞核内NF-κBp65表达量显著升高,且明显高于未转染组细胞；在TNF-α(5ng/m1)+OPG(5ng/m1)处理24h后,转染组细胞核内NF-κBp65表达量较TNF-α单独作用时明显下降,同样情况也见于未转染组细胞。结论：OPG通过抑制血管平滑肌细胞NF-κB的激活发挥抗炎抗凋亡作用。在干扰OPG基因表达后,外源性OPG可抑制TNF-α诱导的NF-κB激活。在转录调节水平揭示OPG的血管保护作用,为AAA的早期干预及药物治疗提供一定理论依据。第四部分腹主动脉瘤患者外周血OPG水平变化及意义目的：血清中OPG水平的变化与多种心血管疾病关系密切。对于血清中OPG水平变化在AAA形成过程中所起的作用,目前仍存在争议。通过对AAA患者外周血OPG水平的测量,明确OPG在AAA患者中的水平变化,揭示其可能存在的代偿性防御机制。方法：根据纳入及排除标准,选择66例数据完整的行腹主动脉CTA检查的患者,其中36例AAA患者作为病例组,30例健康检查者作为对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组血清OPG水平,并进行组间比较。结果：AAA组患者的血清OPG水平明显高于正常对照组(P<0.01)；且OPG水平在不同瘤体直径分组中分布具有统计学差异(P<0.05),相关性检验显示OPG表达水平与瘤体直径成正相关(R=0.844,P<0.01)。结论:AAA患者外周血中OPG水平明显升高,并与瘤体直径增大呈正相关。AAA患者血清OPG水平升高可能是一种代偿性的防御机制,在AAA形成和发展过程中起保护作用。