【摘 要】
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壳寡糖是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1-4糖苷键连接的低聚物,通常含有2～10个氨基葡萄糖,聚合度≤20,分子量小于3 ku。由于壳寡糖聚合度低、水溶性好、易于被肠道吸收、在体内不积累,并且兼具如抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等多种生物活性,被誉为人体第六大生命元素。随着近些年来对壳寡糖的深入研究,发现壳寡糖能够促进动物机体免疫应答能力,在农学、医学等行业中并获得良好应用前景。但由于壳寡糖是
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壳寡糖是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1-4糖苷键连接的低聚物,通常含有2～10个氨基葡萄糖,聚合度≤20,分子量小于3 ku。由于壳寡糖聚合度低、水溶性好、易于被肠道吸收、在体内不积累,并且兼具如抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等多种生物活性,被誉为人体第六大生命元素。随着近些年来对壳寡糖的深入研究,发现壳寡糖能够促进动物机体免疫应答能力,在农学、医学等行业中并获得良好应用前景。但由于壳寡糖是一种混合物,单一聚合度壳寡糖对细胞的调控作用和机制尚不明确。本论文旨在利用五种单聚体壳寡糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7进行刺激,研究不同长度壳寡糖对巨噬细胞的调节机制。本论文取得以下研究成果:1、使用CCK-8检测不同浓度的单聚体壳寡糖对巨噬细胞的毒性。检测结果显示,壳二糖、壳三糖、壳五糖不会对细胞产生毒性,且显著促进细胞的增殖,而壳四糖和壳六糖则在低浓度时显著促进细胞增殖,在高浓度时显著抑制细胞的增殖。2、为探究单聚体壳寡糖对RAW264.7细胞的免疫调控作用,本研究流式细胞术检测其对巨噬细胞的吞噬活性和ROS/RNS释放量的影响,通过荧光定量PCR和ELISA检测巨噬细胞中炎症因子的表达水平。结果显示:（1）在吞噬大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和中性红实验中,所有的单聚体壳寡糖均能提高巨噬细胞的吞噬作用;（2）DCFH-DA和DAF-FM DA荧光探针检测结果显示,不同的单聚体壳寡糖孵育后,巨噬细胞胞内ROS和i NOS表达量显著上升;（3）巨噬细胞经过不同长度的壳寡糖孵育后,通过ELISA和q RT-PCR检测结果显示,壳寡糖能显著提高细胞IL-6的释放量,壳二糖和壳六糖则显著提高TNF-α的表达水平。由以上结果可得,单聚体壳寡糖可以显著激活巨噬细胞RAW264.7吞噬能力和ROS/RNS的释放水平,促进释放炎症因子,增强免疫力,但不同的单聚体壳寡糖对巨噬细胞的激活效果存在差异。3、为探究壳寡糖激活巨噬细胞的分子机制,我们通过Western blot检测巨噬细胞NF-κB信号通路相关的基因和蛋白表达水平。我们根据上述结果筛选出壳二糖和壳六糖进行后续的实验。检测结果显示:（1）在壳二糖和壳六糖的浓度梯度实验中,200μmol的浓度下,壳二糖和壳六糖能显著激活巨噬细胞,促进其炎症因子和膜表面受体的m RNA表达;（2）通过ELISA和Western blot检测结果表明,壳二糖和壳六糖均通过NFκB信号通路激活巨噬细胞,壳二糖依赖于TLR4受体激活巨噬细胞,然而壳六糖可能存在其他受体作用于巨噬细胞。4、我们利用甘露聚糖进一步揭示壳寡糖与甘露糖受体（MR）的相互作用关系。我们的研究结果如下:（1）甘露聚糖竞争性结合MR后,壳六糖对巨噬细胞的激活作用明显下降,吞噬率显著下降,炎症因子释放显著降低,说明MR可能是壳六糖的目标靶点;（2）当甘露聚糖和TAK-242分别处理巨噬细胞后,MR、TLR4、Myd88、NFκB基因的m RNA表达均出现不同程度的显著下降,说明在壳六糖激活巨噬细胞的过程中,膜表面受体MR和TLR4存在一定的相互作用。综上所述,我们发现五种单聚体壳寡糖对巨噬细胞的激活作用并不相同,而壳二糖和壳六糖效果最好,且依赖于NF-κB信号通路对细胞进行调控,这项研究可以为不同长度的壳寡糖在产品开发应用中提供参考。
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