铁是动物和植物所必需的营养元素,铁的缺乏会直接影响到动植物的生长和发育。土壤中Fe的含量虽然十分丰富,但土壤中的Fe大多数以植物不能直接吸收利用的形式存在,因此研究植物的缺铁响应机制对改善植物和人类健康饮食是很有必要的。本课题前期研究发现拟南芥类受体蛋白激酶IOS1可以与Fe3+结合,调节胼胝质的积累,影响胞间连丝的通透性,限制了缺铁响应的转录因子的运动(如PYE),影响其对下游基因(如FRO,IRT1等)的调控。因此,推测IOS1可能是一个铁信号转导过程中上游的一个调控因子,或者是铁受体的一个亚基。IOS1胞内没有激酶区域,因此当它感知到铁的信号后,如何把信号传递下去是我们所感兴趣的问题。本文以WT、ios1、pdlp8、ios1 pdlp8等拟南芥植株为材料,通过免疫沉淀、瞬时转化原生质体,转基因,酵母双杂交等方法,深入研究了 IOS1功能,并且寻找和鉴定了部分互作蛋白。主要获得的结果如下:1.IOS1相关植株材料表型分析为了深入研究IOS1功能,我们以IOS1相关植株材料ios1、pdlp8、ios1 pdlp8、ios1-D及WT为材料,在不同的条件处理下,观察和测定了一些定量和定性的表型。ios1 pdlp8植株中的铁含量,根际酸化能力和根系三价铁还原酶活性均高于野生型,表现出耐缺铁的表型。在加雌二醇的MS培养基,加雌二醇的缺锌和缺锰培养基上,发现ios1-D与WT的根伸长无差异。2.通过IP-MS方法,寻找到可能与IOS1互作的蛋白共有258个。经信息学分析,寻找到和铁可能有关的32个基因并订购这些基因的突变体,我们鉴定获得了 27个基因的纯合突变体的种子,且有18个基因的纯合突变体已收获大量种子。这些突变体中初步研究了其中两个突变体在缺铁条件下的表型实验:在缺铁条件下,相比野生型,lem3.3根伸长无差异,iim根伸长有显著差异,表现出对缺铁的不敏感性。观察叶片黄化的表型发现lem3.3和iim比WT黄化程度较弱。3.IOS1与LEM3.1的互作鉴定氨基酸序列分析:AtIOS1由一段较长的胞外域,单个跨膜区及一段较短的胞内域构成。其与PDLP8相似性较高为52%,其与PDLP1相似性较低为30%。AtLEM3.1包括两端胞外域,两个跨膜区和较长的胞内域。AtLEM3.1在拟南芥中有两个同源基因,进化树分析表明,AtLEM3.1与AtLEM3.2相似性较高。双分子荧光互补实验发现IOS1、PDLP1、PDLP8与LEM3.1有相互作用,与LEM3.2没有相互作用,酵母双杂证明IOS1、PDLP1、PDLP8与LEM3.1也有互作。共定位研究发现IOS1、PDLP1、PDLP8与LEM3.1在质膜上可以共定位。4.通过遗传学方法进一步研究IOS1与LEM3.1关系,我们利用CRISPR/Cas9技术构建的lem3.1 lem3.2 lem3.3三突变体载体及Gateway方法构建的IOS1、PDLP1、PDLP8、LEM3.1的超表达载体,目前正在对转基因材料进行阳性材料筛选。IOS1的定位研究究:用PI和5%NaC1对35S::IOS1:GFP转基因材料根系进行处理,观察发现IOS1定位于胞间连丝。观察IOS1点突材料(C98S/C101S/C200S/C203S)的荧光发现,IOS1四个半胱氨酸突变后,没有影响IOS1的正常定位。