【摘 要】
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大豆(Glycine max(L.)Merr)不仅是重要的经济作物和油料作物,因其富含异黄酮等黄酮类化合物在医药、保健方面也备受关注。随着分子生物学的发展,利用基因工程手段改良大豆品质已经成为可能,本研究优化了大豆胚尖遗传转化体系,构建了高效的过表达载体,将GmMYB12B2基因转入大豆,并完成转基因株系的检测。构建过表达载体pCHF-3300-GmMYB12B2(35S启动子)和pBA-002-
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大豆(Glycine max(L.)Merr)不仅是重要的经济作物和油料作物,因其富含异黄酮等黄酮类化合物在医药、保健方面也备受关注。随着分子生物学的发展,利用基因工程手段改良大豆品质已经成为可能,本研究优化了大豆胚尖遗传转化体系,构建了高效的过表达载体,将GmMYB12B2基因转入大豆,并完成转基因株系的检测。构建过表达载体pCHF-3300-GmMYB12B2(35S启动子)和pBA-002-GmMYB12B2(大豆种子特异性启动子ProGmOLE8)。以吉林35大豆胚尖为外植体,对胚尖划伤的方式,农杆菌侵染方式及时间,Basta筛选剂浓度等可能影响农杆菌转化的因素进行调整优化,实验结果表明:吉林35胚尖三种划伤方式中纵向划伤植株再生率最高,农杆菌侵染过程中真空侵染最佳时间15min,摇床最佳侵染时间为5h,且摇床5h比真空15min侵染植株的转化率高。在诱芽和抽茎阶段向培养基中添加筛选剂Basta浓度为1.8 mg/L筛选效果最好。综合这几项因素,优化后的体系减少了假阳性的出现,同时胚尖外植体具有高再生能力,在一定程度上缩短了培养周期,说明优化的遗传转化体系是可行的。利用PCR、PAT蛋白试纸条、Southern blot及qRT-PCR方法分别检测和验证每个独立转化事件。PCR和PAT蛋白试纸条初步证明T0代中有3株(T0-4、T0-5、T0-7)为阳性转GmMYB12B2过表达株系;利用Southern blot杂交进一步验证了T1代株系,结果证明3株(T1-4、T1-5、T1-7)均为阳性;以吉林35为对照,通过qRT-PCR方法检测了T1代转基因株系中GmMYB12B2的表达情况,与野生型相比均呈显著性提高,同时检测了异黄酮代谢途径中关键酶基因的表达量变化,其中DFR和FLS的表达量与野生型呈显著差异,CHS的表达量为极显著差异。
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