论文部分内容阅读
近年来,长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)表达异常与肿瘤发生发展间的关联逐渐成为研究的热点。GAS家族的生长停滞敏感基因5(growth arrest-specific 5,GAS5)是位于人体内非编码蛋白染色体1q25.1的小开放阅读框,成熟的GAS5在多种肿瘤中表达异常,并通过不同途径发挥作用。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一类影响人类健康的重要卫生问题,其发病率和死亡率均呈上升趋势,因此CRC的早期诊断与治疗意义重大。但目前关于GAS5与CRC发生发展之间的关联及机制的研究较少,证据不足,需要进一步研究。本研究通过病例-对照设计,对CRC患者及对照的外周血及组织样本中GAS5表达进行检测,分析其与CRC发病风险及临床特征之间的关联;并通过对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)的检测,探讨GAS5启动子区多态性位点rs55829688与CRC发病风险和预后的关联。进一步通过检测GAS5在CRC组织及细胞中的表达差异与分布,初步探究GAS5在CRC中的反应机制。接着,通过生物信息学分析与GAS5启动子区多态性位点结合的转录因子,并用EMSA实验与双荧光素酶报告基因系统实验进行验证。最后通过比较siRNA靶向沉默GAS5的CRC细胞系与正常细胞系间各种细胞表型的差异,进一步对GAS5启动子区多态性位点与CRC发生发展间关联性的分子机制进行研究。一、GAS5基因多态性与结直肠癌发病风险的相关性研究1、通过lncRNA表达谱芯片筛选CRC组织与癌旁组织中的lncRNA差异表达谱,重点检测分析目的基因lncRNA GAS5在CRC中的表达差异,确定GAS5在CRC中的调节作用。2、应用千人数据库下载GAS5的位置信息。应用Haploview 4.0软件对GAS5基因进行连锁不平衡(LD)分析。根据SNP之间的连锁不平衡值r2>0.08,最小等位基因频率MAF≥5%的选择标准挑选出tagSNPs,并结合UCSC与NCBI上获取的SNPs位点的位置信息,确定最终SNP rs55829688。3、采用病例-对照设计,通过TaqMan探针法对中国汉族人群中1078例CRC患者和1175例健康人群外周血及组织DNA进行基因分型,分析GAS5基因多态性与CRC风险的关联。随机抽取10%的样本进行盲法重复以保证检测结果的准确性。研究人群基本信息表明,CRC病例组与对照组年龄、性别相匹配,病例组吸烟和饮酒状况均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001,P=0.035)。4、对GAS5基因多态性与CRC风险的关联进行分析,结果表明,相对于rs55829688CC基因型携带者,CT/TT基因型携带者CRC发病风险更高,即rs55829688与CRC发病风险显著相关(P=0.0016)。5、为了进一步评估各混杂因素对GAS5基因多态性与CRC风险的关联性的影响,我们进行了分层分析,结果显示rs55829688 CT/TT基因型携带者在年龄≤56亚组、女性亚组、结肠癌和直肠癌亚组、低分化亚组中CRC发病风险更高,但是患者生存分析并未发现GAS5基因多态性对CRC患者生存时间造成影响。二、GAS5在结直肠癌中的表达及意义在上述研究中,我们明确了GAS5 rs55829688与CRC发病风险的关联性,为了初步探究GAS5在CRC中的反应机制,我们对GAS5在CRC中的表达及分布进行检测,为后续的分子机制研究提供基础。1、通过TCGA数据库分析GAS5在CRC组织与癌旁组织样本中的表达差异,发现GAS5在CRC组织中表达均高于癌旁组织。随后,采用qRT-PCR检测210对人的CRC组织和癌旁组织中GAS5的mRNA水平,结果表明与癌旁组织相比,CRC组织中GAS5的mRNA表达水平更高,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。其结果与TCGA数据库结果一致。2、接着,我们分析了210例CRC患者癌和癌旁的不同基因型组织样本中GAS5的mRNA水平,结果表明,rs55829688 CT/TT基因型样本的GAS5表达水平明显高于CC基因型样本。3、为了明确GAS5在CRC组织中的定位情况,我们利用原位杂交技术对CRC组织及癌旁组织中GAS5的表达及分布进行检测,结果显示相对于癌旁组织GAS5在癌组织中表达更高,且GAS5主要位于CRC的细胞核中;癌旁组织部分未见明显的GAS5表达。4、为了检测GAS5在CRC细胞中的表达差异,采用qRT-PCR技术对不同CRC细胞中GAS5表达进行检测,结果显示CRC细胞中GAS5表达均高于正常结直肠细胞NCM460。5、为了明确GAS5在CRC细胞中的定位情况,我们首先通过GeneCards数据库预测GAS5的定位,结果显示GAS5在细胞核与细胞质中均有分布。接着,对CRC细胞进行胞核胞质RNA提取,通过qRT-PCR检测GAS5表达,结果与GeneCards数据库结果一致,GAS5在胞核、胞质中均有分布,且主要分布于细胞核。三、GAS5启动子区遗传变异与结直肠癌发生发展的关联及其分子机制为充分探讨GAS5启动子区遗传变异与CRC发生发展的关联及其分子机制,首先对GAS5启动子区遗传变异对转录活性的影响进行检测,接着采用EMSA检测GAS5启动子区SNPs与转录因子结合能力。最后构建siRNA干扰的GAS5 Knockdown细胞株,将其与野生型DLD-1、SW480细胞株同时进行细胞表型相关生物学实验检测,探讨GAS5rs55829688影响CRC发生发展的分子机制。1、构建包含rs55829688 T和rs55829688 C的野生型与突变型两种荧光素酶报告基因载体,采用双荧光素酶报告基因系统检测启动子区遗传变异对转录活性的影响,结果显示含有T等位基因的报告基因水平高于含有C等位基因的报告基因水平。2、鉴于基因的启动子区的SNPs可能通过改变与序列特异性转录因子的结合能力从而影响基因转录与表达,我们使用AliBaba2软件对GAS5基因启动子区rs55829688 T>C多态位点所在的DNA序列进行转录因子预测,发现rs55829688 T>C改变可能会影响启动子区与转录因子YY1的结合能力。3、采用EMSA实验检测GAS5启动子区SNPs与转录因子结合能力,发现T等位基因探针与核蛋白结合能力强于C等位基因探针与核蛋白结合能力,即rs55829688 T>C多态性变异减少了转录因子YY1的结合。4、采用siRNA对DLD-1、SW480细胞株进行GAS5敲减,qRT-PCR法检测敲减效率,筛选敲减效率最高的siRNA进行后续转染实验。5、细胞流式结果显示GAS5敲减可以促进CRC细胞的凋亡,且S期、G2-M期细胞比例减少。6、采用western blot检测GAS5敲减对凋亡相关蛋白的影响,发现GAS5敲减后促进了凋亡相关蛋白cleaved PARP和cleaved casepase-3的表达。7、采用CCK-8检测细胞活性,发现抑制GAS5表达后,可抑制DLD-1、SW480细胞增殖能力。8、细胞迁移和侵袭实验表明,抑制GAS5表达可显著降低DLD-1、SW480细胞迁移和侵袭能力(P<0.01)。综上所述,在我们的研究中,我们发现与CC基因型携带者相比,rs55829688 CT/TT基因型的携带者的CRC发病风险明显增加。进一步的功能研究表明,rs55829688 T>C多态性可能会改变转录因子YY1与GAS5结合的亲和力,导致GAS5表达降低,最终抑制CRC的发展。此外,流式细胞术、western blot、迁移、侵袭和CCK-8实验显示GAS5抑制细胞凋亡,促进CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。本研究说明了lnc RNA GAS5基因多态性与CRC遗传易感性的关联及分子机制,为CRC早期诊断及预后提供重要依据。