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目的 该研究从乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）JaGAr-01株中获取prME与E蛋白编码基因，构建到带有FLAG标记基因、CMV以及T7噬菌体启动子的真核表达载体pcDNA（FLAG）3上，分别命名为pJME与pJE；采用脂质体转染法分别将二重组质粒转染于HepG2、KN73以及COS-1动物细胞中，探讨质粒转染剂量和所编码的蛋白表达量之间的关系；分析由pJME与pJE编码的prME与E蛋白在不同哺乳动物细胞内的表达特点；采用肌肉注射与基因枪注射方式将pJME与pJE注射于鼠体内，分析由不同质粒所诱导产生的中和抗体滴度与保护性免疫变化；探讨在转染细胞内蛋白表达水平和DNA免疫效率的相关程度。 材料与方法 细胞、病毒、载体及动物：HepG2与COS-1细胞系分别来自于人肝癌细胞和猴肾细胞，培养于37℃、5％CO2与含10％胎牛血清（Fatal calf serum，FCS）的Dulbeco’modified eagle medium（D-MEM）中；KN73细胞也来源于一种人肝间质细胞，培养于37℃、5％CO2与含10％FCS的RPMI1640中，均用于细胞转染实验。乳地鼠肾细胞（Baby hamaster kidney，BHK）培养于37℃、5％CO2与含1％FCS的Eagle medium（E-MEM）中，用于80％空斑减少中和试验（Plaque reduction neutralization test，PRNT80）。C6／36细胞系来自于蚊细胞并培养于28℃、含10％FCS与相应氨基酸的E-MEM中，用于JEV培养。野生型并具神经毒力的JEV JaGAr-01株，用于质粒构建及以后动物实验中的病毒攻击。所用表达载体为pcDNA（FLAG）3，在其多克隆位点区域内的HindⅢ／BamHI酶切位点之间插入FLAG标记基因（编码FLAG蛋白含8AA’，分子量约1KDa），其同时带有巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）与T7噬菌体启动子。选用雌性、4周龄Balb／c鼠进行DNA免疫动物实验，免疫鼠在病毒攻击后被观察21日，每天检查其生存状态。 JEV prME与E蛋白编码基因的重组构建：从JEV感染的C6／36细胞中提取细胞内总RNA。RT-PCR方法分别扩增出JEV prME（2001bps）与E （1500hP）基因片段。两个不同 5’末端引物：5’－ATG AAG hG TCA AAT’ITC CAG GGGA，符合于 prME区域第 477至 501 核昔酸（nucleohde，nt）位点；5’－’I’IVf AAT TGT CTG GGA ATG GG，位于 E区域第978至997nt位点。共用相同 3’末端弓！物：5’－AGC ATG CAC Aw GCT CGC TAA GAA，互补于2454至 2477nt位点。此外，限制性内切酶 BaxnHI合成于 5’末端引物，Eec－Al合成于 3’末端引物。使用 QIAqUick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化 RT－PCR产物，ABI－PRSM＊310Genetic Analyzer（Pekin－Elmer／Applied）测序分析，并与发表的JaGAr－01株核酸序列进行比较。将BamHI／EcoAI酶消化的RT－PCR产物插于PcDNA厂LAG产的BamHI／EcoRI酶切位点之间。含有JEV PrME与E基因片段的重组质粒分别命名为PJME与PJE。将二者分别转化于大肠杆菌 JM109中并经 LB琼脂培养（AmPicillin，70u吵IIl，Sig－ma）筛选出阳性菌落，接种于 Znil LB培养液中，碱裂解法提取质粒。Burn－HI／ECORI酶切鉴定，再经位于载体上的’I7噬菌体启动子引物进行测序分析，以检测插人子与载体间的接合位点。扩增培养鉴定后的克隆，重复前述的鉴定步骤。再次鉴定后的质粒被调整成终浓度ling／Inl保存并用于转染实验。 pJME小JE的转染与表达：不同量的重组质粒分别为pJME：10 pg／well，sugiwell，3ug／well；PJE：10u吵well，swg／well，3ug／well；同时以 10ugiwellPCDNA厂LAG乃为阴性对照。采用脂质体转染技术将重组质粒转染于HePGZ细胞。具体为：将不同量 PJME、PJE以及 PcDNA厂LAG万分别与＊…脂质体混合后配制成终体积＊0…＊＊A许质体混合物，室温孵育15分钟后加人预先经无FCS的D－MEM冲洗的HepGZ细胞中，37℃3 ／J＼时孵育后更换新鲜含 10％FCS D－MEM培养液继续培养 48小时，收集细胞并悬浮于TE BufferhH7．5人以检测由重组质粒中插人子所编码的PrME上蛋白的表达。采用Anti－FLAG抗体系统检测分析HePGZ细胞内带有FLAG标记蛋白的JEV PrME下蛋白的表达特征。简言之，细胞裂解物经10％SDS一聚丙酸胺凝胶电泳，每种样品上样总量 20屿，之后转印于尼龙膜过夜（Transfer buffer＊．1呢SDS，25mM Tis，192InM Glycine，20啪Methanol），取膜经 TING－N b伽r（50mM Tis pH7．5，smM EDTA，150mM NaCI，0．25阮 Geratin，0．05％ Nonident P－40）室温处理 2 X 15分钟，将鼠源性 Anti－FLAG单抗与膜在 37℃反应 60分钟，TING－N b业r室温洗膜 2 x 15分 ·2·钟，将膜与连接辣根过氧化酶羊抗鼠IgG在37t反应60分钟，再次洗膜二X 15分钟，选用放大化学发光蛋白杂交检测系统检测结果，并经计算机软件 STORM860扫描成像。以 10Pglwell 的 PJME与 PJE分别转染于 KN73与COS八细胞，采用Anti－FLAG系统进行Western blot分析，检测相关蛋白在细胞内的表达特点，方法同前。采用Anti－E特异性抗体系统检测HepGZ人OS－1细胞内 E蛋白的表达。取前述的 10卜g／well pJME＊卜g／well