慢性粒细胞白血病(慢粒)是一种以BCR-ABL融合基因形成为特点的骨髓增殖性疾病,年发病率约1.0-1.5/105,罕见于儿童,在西方国家中中位患病年龄约为50-60岁。我国发病率约0.36-1.0/105,慢粒的临床表现有体重减轻、乏力、多汗、出血、脾大、贫血等。该疾病的病程分为三期,包括慢性期、加速期、急变期。90%以上的慢粒患者确诊时尚处于疾病相对早期阶段,即慢性期(CP)。目前慢粒慢性期患者使用酪氨酸激酶抑制剂如一代伊马替尼或二代尼洛替尼、达沙替尼治疗后,效果较理想,但仍有近20%的慢粒慢性期患者对治疗不敏感,这些患者发生疾病进展的可能性极大,一旦进展至急变期(BP),治疗效果不佳,死亡率极高。慢粒急变是指慢性粒细胞白血病转变为急性白血病的过程,是慢性粒细胞白血病终末期最常见的表现,中位生存期仅有6个月左右。对常规联合化疗、干扰素治疗等治疗反应差,酪氨酸激酶抑制剂疗效不佳且短暂。异基因造血干细胞移植几乎是慢粒急变期唯一有效的治疗方法,然而,由于存在配型成功机率较低、发生移植物抗宿主病(GVHD)治疗相关副作用、治疗费用高、老年人耐受性差等缺点,异基因造血干细胞移植难以广泛应用。因此,阐明慢粒急变的发生机制、寻找新的分子靶点成为慢粒研究中的关注热点。现有研究倾向于认为慢粒急变的机制包括BCR-ABL依赖性和BCR-ABL非依赖性两类。BCR-ABL融合基因的形成对慢粒发生发挥重要的驱动作用,它与慢粒急变也密切相关。然而,近年来越来越多的研究发现慢粒急变过程中存在BCR-ABL非依赖性机制,如一些转录因子以及表观遗传调控基因在慢粒急变中发挥一定的作用。因此慢粒急变过程中可能存在复杂的分子调控网络,挖掘分子调控网络中的节点分子是探讨慢粒急变机制及寻找新型治疗靶点的基础。表观遗传学是指不改变DNA序列的同时基因表达却发生了可遗传的变化。主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等,目前认为,表观遗传修饰参与调控多种细胞生物学过程,包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等。表观遗传修饰异常通过促进致癌基因表达或抑制抑癌基因表达在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用。研究发现,慢粒急变过程中存在DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传修饰异常,它们在慢粒急变过程中发挥了重要作用,然而关于另外两种表观遗传修饰异常,即组蛋白去甲基化酶和非编码RNA是否在慢粒急变中发挥作用,相关研究甚少。在本项研究中,我们发现在慢粒白血病患者标本中组蛋白去甲基化酶RBP2和非编码RNA-miR-370表达异常,为此,我们选择RBP2和miR-370作为研究对象,通过细胞分子水平的研究探讨它们在慢粒急变过程中的作用及其机制,以期为发现干预慢粒急变的新靶点提供理论基础。第一部分组蛋白去甲基化酶RBP2调控miR-21介导慢粒急变的表观遗传学机制视网膜母细胞瘤结合蛋白2(RBP2)是JARID1蛋白家族的一员,是一种特异性作用于组蛋白H3第四位赖氨酸(H3K4) Me2/Me3使其发生去甲基化的组蛋白去甲基化酶。RBP2调控多种基因的表达,从而决定着细胞命运,对发育、增殖、分化、衰老、血管生成、EMT及昼夜节律等多种生物学效应均有影响。Defeo-Jones D等最先发现RBP2可与pRb蛋白结合,继而多个研究发现RBP2还可与其他多种蛋白结合,例如p107、RBTN-2、PRC2、Mad、RBP-J、RunX2、CLOCK-BMAL1、G9a等。2007年,Klose RJ等首次发现RBP2具有H3K4去甲基化酶活性,作为组蛋白去甲基化酶发挥作用。进一步研究证实RBP2表达失调参与多种肿瘤的发生发展,例如乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等,白血病是不同于实体瘤的液体肿瘤,RBP2在慢粒急变中是否发挥作用目前尚不清楚,值得探讨。研究目的：本实验旨在通过检测RBP2在慢粒慢性期、急变期患者标本中的表达差异、RBP2对白血病细胞K562和HL60分化、增殖的影响以及与miR-21的调控关系,探讨RBP2在慢粒急变中的作用及机制。研究方法：(1)用qRT-PCR、免疫组织化学法检测慢粒慢性期和急变期患者标本中RBP2 mRNA和蛋白的表达。(2)检测RBP2对白血病细胞分化和增殖的作用以BCR-ABL(+)白血病细胞系K562和BCR-ABL(-)白血病细胞系HL60为研究对象。用体外分化诱导剂DMSO、ATRA分别诱导K562和HL60细胞分化,qRT-PCR和Western Blot检测RBP2和粒系分化相关基因(c-myc、Notch1、PU.1) mRNA和蛋白的表达。采用RBP2真核表达质粒瞬时转染的方法,使其过表达,做细胞生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测RBP2对白血病细胞增殖的影响。(3)研究RBP2介导慢粒急变的机制①RBP2负性调控miR-21及其作用机制转染RBP2真核表达质粒至K562细胞中,用miRNA芯片筛选下游miRNA。选择芯片筛选并经qRT-PCR验证的表达显著下调的miR-21作为研究对象。双荧光素酶活性实验检测RBP2过表达后,miR-21野生型和突变型启动子活性的变化。用EMSA和CHIP实验确定RBP2直接结合至miR-21启动子区域,及其对启动子区域H3K4甲基化水平的影响。②RBP2通过靶向抑制miR-21进而激活PDCD4表达介导的生物学效应转染miR-21 mimics/inhibitor至K562和HL60细胞中,qRT-PCR和Western Blot检测PDCD4 mRNA和蛋白表达。对K562和HL60细胞均进行不同处理,将其分为以下四组,即对照组(Vector组)、转染RBP2真核表达质粒组(RBP2组)、共转染对照组(Vector+NC组)、共转染RBP2真核表达质粒和miR-21 mimics组(RBP2+miR-21组),qRT-PCR和Western Blot比较四组间PDCD4 mRNA和蛋白表达变化,以及细胞增殖速率和克隆形成能力的变化,从而研究RBP2对PDCD4的调控作用及其所介导的生物学效应是否依赖于miR-21。研究结果：(1)在慢粒急变骨髓标本中,RBP2表达降低在随机选择的26例慢粒慢性期患者骨髓标本和18例慢粒急变期患者骨髓标本中,慢粒急变期患者骨髓标本中RBP2表达较慢性期患者显著降低。(2)RBP2参与诱导白血病细胞分化分别用DMSO和ATRA诱导K562和HL60细胞分化成熟后,RBP2 mRNA和蛋白水平均显著升高。粒系分化相关基因c-myc和Notchl表达显著下调,而PU.1表达则显著上调。在慢粒急变患者原代细胞中也得到了与细胞系中相同的结果。(3)RBP2过表达抑制白血病细胞增殖转染RBP2真核表达质粒到K562和HL60细胞,细胞生长曲线显示RBP2过表达组的细胞增殖速率降低,软琼脂克隆形成实验结果显示RBP2过表达组的克隆形成能力明显降低。(4)在白血病细胞和慢粒原代细胞中RBP2下调miR-21表达转染RBP2真核表达质粒至K562和HL60细胞以及慢粒慢性期、急变期原代细胞中,使其过表达后,qRT-PCR结果显示miR-21表达水平显著降低。(5)RBP2结合至miR-21启动子区域并通过改变启动子区域H3K4甲基化水平直接调控miR-21表达转染RBP2真核表达质粒+miR-21野生型／突变型双荧光素酶报告基因载体+TK质粒至K562和HL60细胞后,双荧光素酶活性检测实验结果显示RBP2过表达后,miR-21野生型启动子活性显著降低,而突变型启动子活性无明显变化。EMSA和CHIP实验结果显示RBP2直接结合至miR-21启动子区域。RBP2过表达后,CHIP实验发现RBP2与miR-21启动子的结合增多,H3K4 Me2/Me3水平明显降低,组蛋白Western Blot还发现K562和HL60细胞中H3K4 Me2/Me3整体水平也显著降低。(6)RBP2通过抑制miR-21表达诱导细胞分化及抑制细胞增殖单独转染RBP2真核表达质粒、共转染RBP2真核表达质粒和miR-21 mimics至K562和HL60细胞中,细胞生长曲线和软琼脂克隆形成实验结果显示miR-21过表达显著回复了RBP2过表达所抑制的细胞增殖。检测慢粒急变期患者骨髓标本中miR-21表达较慢性期显著升高。(7)PDCD4是miR-21的直接靶基因,可促进细胞分化及抑制细胞增殖分别转染miR-21 mimics/inhibitor至K562和HL60细胞后,qRT-PCR和Western Blot结果显示miR-21负性调控PDCD4表达。用DMSO或ATRA诱导K562和HL60细胞分化后,PDCD4 mRNA和蛋白水平均上调。此外,转染PDCD4真核表达质粒至K562和HL60细胞中使其过表达后,PDCD4过表达组的细胞增殖速率显著降低,同时克隆形成能力也显著降低。研究结论：(1)RBP2在慢粒急变中表达降低。(2)RBP2促进白血病细胞分化,抑制白血病细胞增殖。(3)miR-21是RBP2的下游直接靶基因。RBP2通过直接结合至miR-21启动子并且改变启动子区域H3K4 Me2/Me3水平来调控miR-21表达。(4)RBP2所介导的生物学效应至少部分通过miR-21来实现。miR-21通过靶向调控PDCD4发挥作用。第二部分miR-370通过调控FoxM1增加慢粒急变细胞系K562对HHT的敏感性MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的小的非编码RNAs,长约20-25个核苷酸。miRNAs通过结合于下游靶基因的3’非翻译区(3’UTR)调控基因表达,或转录后抑制基因表达,或导致靶mRNA降解。miRNAs影响多种细胞生物学过程,例如发育、增殖、分化、凋亡等。miRNAs表达失调参与多种肿瘤的发生发展过程中。近年的研究表明,miRNAs在肿瘤细胞对化疗药物增敏或耐药方面也发挥着重要作用。高三尖杉酯碱(HHT)是一种传统中药,是从三尖杉属植物中分离出的一种抗肿瘤生物碱,成功应用于各类白血病的治疗方案中。HHT主要杀伤G1和G2期细胞,抑制蛋白质合成,诱导细胞分化,促进细胞凋亡。有研究表明在伊马替尼耐药的细胞系和慢粒急变原代细胞中,HHT与伊马替尼具有协同作用。此外,HHT与Ara-C? IFN-α也具有协同作用。在美国进行的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验证实了HHT在慢粒治疗中的重要作用,但仍存在药物副作用的问题。因此,寻找与HHT具有协同作用的药物靶点进行共同干预,可降低HHT用药剂量,从而降低HHT相关副作用的发生率及其严重程度,是慢粒急变治疗中值得关注的问题。我们之前的研究表明miR-370在AML中表达下调,且miR-370通过靶向调控FoxMl表达影响细胞增殖。然而,miR-370在慢粒急变中是否发挥作用,是否可作为慢粒急变治疗的新靶点目前尚不清楚。研究目的：本实验旨在通过研究miR-370在慢粒慢性期、急变期患者标本中的表达差异及其对慢粒急变细胞系K562凋亡和HHT所诱导的细胞凋亡的影响,探讨miR-370在慢粒急变中的作用及机制。研究方法：(1)用qRT-PCR检测慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本中miR-370的表达。(2)在慢粒急变细胞系K562中研究miR-370的作用及其机制①用流式细胞术检测miR-370表达异常对细胞凋亡及HHT所诱导的凋亡的影响转染miR-370 mimics和／或HHT处理K562细胞后,将K562细胞分为五组,即对照组(NC组)、单独用HHT处理(HHT组)或单独转染miR-370 mimics(miR-370 mimics组)或HHT处理6h后再转染miR-370 mimics/NC(HHT+miR-370 mimics组、HHT+NC组),检测不同处理组细胞凋亡率。HHT处理细胞(HHT+NC组)或HHT处理细胞后再转染miR-370 inhibitor (HHT+miR-370 inhibitor组),检测不同处理组细胞凋亡率。②用流式细胞术检测FoxMl在miR-370所介导的生物学效应中的作用转染miR-370 mimics和／或FoxMl真核表达质粒后,即分为miR-370 mimics组、FoxM1真核表达质粒组、miR-370 mimics+FoxMl真核表达质粒组,检测不同处理组细胞凋亡率。转染miR-370 inhibitor和／或FoxMl siRNA后,检测不同处理组细胞凋亡率,包括miR-370 inhibitor组、FoxMl siRNA组、miR-370 inhibitor+FoxMl siRNA组。(3)研究HHT不同浓度及不同作用时间对miR-370和FoxMl的调控作用用不同浓度HHT处理慢粒急变细胞系K56272h后,或用同一浓度HHT处理K562细胞72h和96h后,qRT-PCR和Western Blot分别检测两种不同处理方式下miR-370和FoxMl表达变化。研究结果：(1)在慢粒慢性期和急变期患者骨髓标本中,miR-370和FoxMl表达失调在随机选取的23例慢粒慢性期患者、10例慢粒急变期患者和14例正常健康对照骨髓标本中,qRT-PCR检测发现与正常健康对照相比,慢粒慢性期患者骨髓标本中miR-370表达降低,且急变期患者骨髓标本中miR-370表达进一步降低。而FoxMl表达则与之相反,其表达随着慢粒疾病进展而升高。(2)miR-370表达上调可增加K562细胞对HHT的敏感性收集不同分组的细胞,即对照NC组、HHT组、miR-370 mimics组、HHT+miR-370 mimics组和HHT+NC组,流式细胞术检测不同处理组的细胞凋亡率。结果显示miR-370mimics和HHT均可诱导细胞凋亡。值得注意的是,HHT+miR-370 mimics组细胞凋亡率较HHT组和HHT+NC组均显著增高。(3)miR-370通过抑制FoxMl表达介导其药物增敏功能在K562细胞中,转染miR-370 mimics和／或FoxMl真核表达质粒后,细胞凋亡率检测结果显示FoxMl过表达逆转了miR-370过表达所诱导的细胞凋亡。反之,转染miR-370 inhibitor和／或FoxM1 siRNA后,结果显示FoxMl低表达逆转了miR-370低表达所抑制的细胞凋亡。(4)在K562细胞中,HHT上调miR-370表达与浓度及时间相关用不同浓度HHT处理K562细胞72 h后,qRT-PCR结果显示miR-370表达水平升高,呈浓度依赖性；用同一浓度HHT处理不同时间后,qRT-PCR结果显示miR-370表达水平也升高,呈时间依赖性。研究结论：(1)miR-370在慢粒发生中表达下调,在慢粒急变过程中表达进一步下调。(2)miR-370过表达可增加白血病K562细胞对HHT的敏感性。(3)miR-370通过抑制FoxM1表达介导其药物增敏功能。(4)HHT能够上调miR-370表达,呈浓度及时间依赖性。