论文部分内容阅读
实验目的:近年来,噬菌体裂解酶被认为是一种治疗耐药菌感染的有效替代品。但由于天然噬菌体裂解酶具有较强的菌属特异性,与抗生素相比其杀菌谱较窄,不会破坏正常的菌群,但这同时也限制了此类分子在混合菌感染类疾病方面的应用。因此,本研究报道了一个较为广谱的嵌合裂解酶ClyE,它是由天然噬菌体裂解酶PlyGBS的催化域和PlySs2的细胞壁结合域融合表达而来。实验方法:①利用大肠杆菌BL21和镍柱亲和层析法对嵌合裂解酶ClyE进行原核胞内诱导表达和纯化;②稀释平板计数法定量ClyE在PBS缓冲液中对无乳链球菌S12的杀菌活性;③透射电镜表征ClyE的初步作用机制;④ClyE酶学性质的表征,稀释平板计数法定量ClyE在牛奶中的杀菌活性以及通过酶标仪监测细菌浊度的降低评定ClyE在不同温度,pH,EDTA,NaCl条件下的稳定性;⑤通过酶标仪监测细菌浊度的降低测定ClyE的杀菌谱;⑥CCK-8实验测试了 ClyE对肺上皮细胞A549的细胞毒性;⑦此外,本研究还进一步在全身感染无乳链球菌XQ-1的斑马鱼模型上验证了 ClyE的抗菌效果。实验结果:①ClyE可以在大肠杆菌中正确表达,经镍柱亲和层析纯化后其纯度和溶解度均较为理想;②ClyE对无乳链球菌具有高效快速的裂解活性。100 μg/ml ClyE能在60分钟内使无乳链球菌S12菌浓降低约2个数量级。③透射电镜切片显示,ClyE能够快速使细菌细胞壁裂解,从而发挥杀菌的作用,这与之前报道的裂解酶作用方式一致。④酶学性质测试表明,ClyE在牛奶中的杀菌活性与在PBS缓冲液中基本一致;在45℃以下,pH7.0-9.0时能保持较好的活性;即使NaCl浓度达到500 mM,ClyE仍保持较高的活性。⑤它的杀菌谱较广,包括了无乳链球菌、停乳链球菌、化脓链球菌、猪链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌。⑥CCK-8实验表明,1000 lμg/ml的ClyE与A549细胞共同孵育24小时后也没有检测到明显的细胞毒性。⑦在感染无乳链球菌XQ-1的斑马鱼动物模型中,单次腹腔注射2 μg/尾的ClyE后,与阴性对照组相比可显著提高其存活率(100%vs 10%),与青霉素组相比,其生存率也有所提高(100%vs 80%)。实验结论:ClyE的这种广谱性和安全性为治疗耐药混合菌感染提供了一种很好的选择。