论文部分内容阅读
重寄生真菌是指以菌丝、菌丝体或假组织的形式寄生于另一真菌并吸取寄主营养的真菌。近年来，重寄生真菌作为一类极具应用潜力的生防真菌，人们对它的研究已从单纯的生物资源调查转向毒力因子和侵染寄主的分子机理的诠释，尤其在毒力因子的鉴定及其生理生化性质等方面的研究有了较大进展。多数研究者认为，重寄生真菌在侵染和穿透寄主细胞壁的过程中所产生的真菌细胞壁降解酶是重要的毒力因子，在重寄生真菌侵染过程中起着直接作用。其中包括几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶等。由于真菌细胞壁中含有大量的几丁质和葡聚糖，所以几丁质酶和葡聚糖酶的作用更为重要。但是，在自然条件下，重寄生真菌所产生和分泌的胞外酶的浓度较低，因此提高重寄生真菌与侵染相关的胞外酶的表达对增强生防真菌防治效果也有潜在的应用价值。长期以来，人们一直以木霉作为重寄生真菌的研究对象，而对其它重寄生真菌类群鲜有深入研究。为扩大重寄生真菌的研究背景和范围，提供更多可供参考的重寄生作用机理的证据，服务于生物防治的应用以及开发，有必要筛选更多有生防潜力的真菌并加以深入研究。
在以上研究背景下，本论文主要开展了以下几个方面的研究工作：1)重寄生真菌筛选，确定毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)为出发菌株；2)对毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)的侵染毒性因子β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶进行了分离纯化和性质鉴定；3)克隆了毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)胞外几丁质酶的全长编码基因和cDNA序列；4)对毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)的几丁质酶成熟肽进行了异源表达。取得如下研究结果：
1.重寄生真菌的筛选：通过平板对峙培养，在显微镜下观察重寄生真菌对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的寄生情况，并测定发酵液胞外酶的活性。从47个出发菌株中筛选到1株具有较高胞外酶活性和抑制真菌活性的重寄生真菌—毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)作为出发菌株。毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.Q0843)可附着生长于寄主立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌丝体上，并伴有少数的菌丝体缠绕现象。
2.通过活性电泳的方法在毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)中纯化了与侵染相关的胞外β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶。生化分析表明，β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的分子量分别为70kDa和45kDa，最适温度分别为30℃和40℃，最适pH都是6，。它们对温度比较敏感。β-1,3-葡聚糖酶在pH5-7之间比较稳定，而几丁质酶则对碱性条件的耐受性比较强。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的抑菌活性检测结果表明，纯化的两种酶都可以单独抑制立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌丝生长。毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)的β-1,3-葡聚糖酶的N末端氨基酸序列为PYQLQTP，与其它真菌来源的β-1，3-葡聚糖酶的N末端氨基酸同源性较低。
3.克隆得到毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)胞外几丁质酶全长编码基因。根据已经报道的其它生防真菌来源的几丁质酶编码基因的同源性分析，设计简并引物扩增得到毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)几丁质酶保守基因片段，大小为500bp。再根据扩增得到的几丁质酶保守基因序列设计巢氏PCR引物，采用DNAWalking技术扩增得到几丁质酶保守序列两端未知的上游和下游序列，并利用DNAman软件拼接得到几丁质酶全长编码基因，该基因的编码序列包括1275bp，含有两个内含子和三个外显子，编码424个氨基酸。与其它生防真菌(木霉和黄绿绿僵菌等)来源的几丁质酶具有较高的同源性。
4.毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)几丁质酶成熟肽异源表达分析。根据毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)几丁质酶编码基因设计一对含有EcoRⅠ和NotⅠ识别位点的特异性引物，提取毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)总RNA，通过RT-PCR扩增得到成熟肽的编码序列，并克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a-c(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21并进行转化分析。
论文的创新性主要为：
1.首次对重寄生真菌毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)胞外酶(β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶)的抑菌作用进行了研究，并证实它们对病原菌(烟草赤星病原菌和立枯丝核菌)的抑制作用。
2.分别纯化了毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶，首次对毛壳菌的胞外酶的生化性质进行较系统的研究。
3.首次克隆了毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)的几丁质酶全长编码基因。