论文部分内容阅读
瘤胃内日粮蛋白质的降解是许多不同的微生物分泌的酶共同参与的复杂过程,尤其是细菌。尽管瘤胃内蛋白质的降解为瘤胃微生物的生长提供了所需的肽和氨基酸,被用来合成微生物蛋白,但仍有部分蛋白被降解为氨排出体外,导致氮的严重流失。本研究利用体外厌氧培养法、DGGE和16S rDNA文库方法,研究不同氮源对瘤胃蛋白降解菌产氨速率的影响,分析蛋白降解菌的种类和多样性,有助于揭示蛋白质在瘤胃内降解的微生物机理,为减缓蛋白降解速率,增加氮利用率提供理论依据。试验一：不同氮源条件下蛋白质降解菌的产氨量分析为了研究在氮源下,分析不同蛋白质降解菌的产氨效果,为蛋白质降解菌的多样性分析提供基础比对数据。本试验利用体外厌氧培养方法,以酪蛋白和酸水解酪蛋白为不同氮源,添加莫能菌素进行不同脱氨酶活性蛋白降解菌连续21h的富集培养,试验处理分为：NN,对照组；P,酪蛋白组；P-M,酪蛋白加莫能菌素组；AA,酸水解酪蛋白组；AA-M,酸水解酪蛋白加莫能菌素组。通过测定培养基中0、7、14和21h氨氮变化量确定不同脱氨酶活性的蛋白质降解菌氨产生速率的变化。酸水解酪蛋白作为氮源时的产氨率(439.04nmol mg-1h-1)高于酪蛋白作为N源时的速率(39.34nmol mg-1h-1)(P<0.05)。莫能菌素在7h后能抑制酸水解酪蛋白的产氨量,在14h后抑制酪蛋白的产氨量,且21h后,莫能菌素可显著抑制氨的产生速率(P<0.05),相比于酪蛋白,更倾向于抑制酸水解酪蛋白作为氮源和能量的来源。试验二：DGGE分析不同氮源条件下蛋白质降解菌的种类和多样性为解析蛋白降解菌的种类和多样性,阐明不同氮源对蛋白降解菌群落结构的影响。通过体外法添加不同氮源,在试验一的基础上,分析氨产生速率有显著差异的时间点,即21h采集培养基样品,提取DNA,利用通用引物扩增蛋白降解菌16S rDNA V3区,进行DGGE图谱分析,挑取差异显著性条带进行割胶回收,然后将目的基因片段连接载体pMD19-T,转化E.coli JM109后,进行测序。Quantity-one软件进行DGGE指纹图谱分析,并对条带进行聚类和生物多样性分析。将测得的16S rDNA V3区序列提交至GenBank数据库进行比对分析。结果表明：(1)添加酪蛋白和酸水解酪蛋白为基质作为能量和氮的来源,及其对应添加莫能菌素的DGGE指纹图谱的条带位置和光密度值有差异,且添加莫能菌素的条带少于未添加时的条带数目。(2)酪蛋白作为基质时菌的生物多样性最高,其次为酸水解酪蛋白,酸水解酪蛋白和莫能菌素,酪蛋白和莫能菌素。莫能菌素可抑制产氨菌的多样性。(3)参与酪蛋白降解的菌属主要有Prevotella、Anaerovibrio、Pseudobutyrivibrio和Oribacterium等,参与酸水解酪蛋白降解的菌属主要有Anaerovibrio、Clostridium、Pseudobutyrivibrio、 Megasphaera和Prevotella等菌属。(4)脱氨酶活性高又对莫能菌素敏感的酪蛋白降解菌属有Pseudobutyrivibrio、Acidovorax、Butyrivibrio、Eubacterium和Limnobacter等,及酸水解酪蛋白降解菌Clostridium和Pseudobutyrivibrio等。(5)对莫能菌素不敏感的酪蛋白降解菌有Oribacterium和Selenomonas,能对莫能菌素有抗性的酸水解酪蛋白降解菌有Bacteroides、Enterobacteriaceae、Porphyromonadaceae和Selenomonas。试验三：基于16S rDNA文库分析不同氮源条件下蛋白质降解菌的多样性为进一步精确解析蛋白降解菌的种类和多样性,利用试验二的DNA样品,进行PCR扩增16S rDNA样品,割胶回收,连接转化后,随机挑取230个克隆进行测序。将序列整理后(同上),用Pregap4软件对序列进行质量控制,并去除载体序列,用Mothur软件以97%的序列相似度进行OTU(分类单元)归类划分,将OTU序列提交RDP数据库进行种属分类。结果表明：(1)酪蛋白培养基中OTU个数最多,且比其添加莫能菌素后的多5个OTU,但以酸水解酪蛋白作为基质且添加莫能菌素比未添加时少1个OTU。Gammaproteobacteria门只属于酸水解酪蛋白和莫能菌素组(OTU22)和对照组(OTU35)。(2)酪蛋白和酸水解酪蛋白培养基中蛋白降解菌基因序列的主成分不同,对应基质添加莫能菌素后,相同氮源培养基的蛋白降解菌序列主成分差异不显著。(3)某些革兰氏阳性菌如Clostridium对莫能菌素具有敏感性,革兰氏阴性菌如Prevotella、Pseudobutyrivibrio与Megasphaera同样对莫能菌素有敏感性。(4)参与降解酪蛋白的优势菌有Anaerovibrio、Pseudobutyrivibrio、Oribacterium和Clostridium,参与酸水解酪蛋白的优势菌有Anaerovibrio、Clostridium、Prevotella与Selenomonas。(5)对莫能菌素敏感的酪蛋白降解菌有Clostridium、Lachnospiracea、 Pseudobutyrivibrio和Prevotella等,及酸水解酪蛋白降解菌有Clostridium、Prevotella和Schwartzia。(6)对莫能菌素具有抗性的水解酪蛋白的菌有Butyrivibrio与Oribacterium及酸水解酪蛋白降解菌Megasphaera和Succinivibrio。(7)菌属Prevotella sp.和Anaerovibrio在酪蛋白和酸水解酪蛋白降解过程中起重要作用。