肿瘤的形成过程是一个多阶段的、复杂的过程并且涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活。正常时原癌基因是不致癌的,当人体受到细菌、病毒、理化因素和精神因素刺激时,原癌基因被激活,发生异常,致使人体细胞增生不受控制、出现异常增生、发生恶性变,形成肿瘤。人体还存在着一种抑癌基因,它可以控制人体细胞正常分裂、增值,抑制细胞的异常增生和癌变。当抑癌基因受到病毒感染、电离辐射等损伤后,肿瘤抑制基因功能丧失,细胞正常分裂与增生的平衡被打破,使细胞分裂与增殖不受控制,细胞出现异常增生或异倍体增殖,细胞突变、形成肿瘤。近年来多个研究表明TXNIP基因在肿瘤的进展和转移过程中担任着重要的角色,TXNIP基因是一个新的抑癌基因,它在人类肝癌、肺癌等癌组织中均表达下降,并且与肿瘤的转移相关,TXNIP的缺失可以促使肿瘤细胞的增殖和抑制细胞凋亡的进程。伴随着人类基因组计划的完成,各种基因的筛选已成为目前基因研究的热点,而探索肿瘤进展和转移的相关基因对判定肿瘤的预后、指导治疗措施的选择及研发新的治疗措施和方案都具有重要的指导意义。一、研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在我国占全身各种恶性肿瘤的7%-10%,呈逐年上升趋势,部分大城市报告乳腺癌占女性恶性肿瘤之首位。20岁前本病少见,20岁以后发病率迅速上升,45-50岁较高,绝经后发病率继续上升,可能与年老者雌酮含量提高相关。月经过早来潮(小于12岁)或绝经晚(迟于55岁),未生育,晚育(第一胎在35岁以后)或生育后不哺乳,乳癌的发生率较高。近年来,随着诊断和治疗水平的不断进步,对乳腺癌患者术后的5年生存率,乳腺癌术后生存质量都有很大的提高,但是晚期乳腺癌的治疗效果仍然有待提高。因此,关于乳腺癌发病因素的探讨,以期早期发现、早期治疗并提高临床疗效已成为临床研究的重点之一。硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP),又名维生素D3上调蛋白1(vitamin D3up-regulating proteinl,VDUPl),,是a-视紫红质抑制蛋白家族成员之一,而且是家族中唯一可以与硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)结合的蛋白。TXNIP能通过与Trx活性半胱氨酸残基的结合而抑制其抗氧化功能,同时参与调节体内活性氧系统以及线粒体通路的过程,诱导细胞的凋亡程序,表现了TXNIP在细胞发育过程中的介导作用。编码TXNIP的基因位于人染色体1q21-22,包含8个外显子,长4174bp。TXNIP基因首次在用1,25二羟基维生素D-3处理的人类白血病细胞系HL-60中被发现,研究表明,TXNIP基因相关的细胞增殖周期失控和NK细胞发育异常等与肿瘤发生和转移联系密切。目前关于TXNIP在乳腺癌中表达情况的报道甚少,与临床病理特征的关系尚无公认的结论。为此,我们采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测16例乳腺癌和配对癌旁组织中的TXNIP mRNA的表达水平,用免疫印迹(western blot)法检测7例乳腺癌及配对癌旁组织中的TXNIP蛋白表达水平；用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法(SP法)对50例乳腺癌及配对癌旁组织中的TXNP蛋白进行半定量检测。应用SPSS13.0统计软件,分别探讨TXNIPmRNA在乳腺癌及配对癌旁组织中的表达水平,和TXNIP蛋白在乳腺癌和癌旁组织重的表达水平及其与乳腺癌患者年龄、临床分期、病理组织学分化等的关系。二、方法与内容1.研究对象本研究共收集南方医科大学南方医院2011-2012年间存档的50例乳腺癌及配对的癌旁组织,所有患者术前均未经化疗或放疗,病理诊断浸润性导管癌。其中年龄<50岁29例,年龄>50岁21例,平均年龄44.68岁；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期20例,Ⅲ～Ⅳ期30例；中高分化乳腺癌26例,低分化乳腺癌24例。组织标本蜡块常规切片。2.研究方法A. qRT-PCR法检测TXNIP mRNA的表达a.样品总RNA的制备：PBS清洗组织样品,剪碎,液氮中研磨。然后采用TRIZOL法提取组织细胞中的总RNA,用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检提取到的RNA的完整性、纯度和含量。b.cDNA合成反转录前直接将6.5ul的RNA加入到反转录体系中合成cDNA。反应体系为10ul,其中PrimeScript RT Enzyme Mix10.5ul、5×PrimeScript Buffer2ul、Oligo dT Primer(引物)0.5ul。于PCR仪进行反转录,反应条件为：37℃15min,85℃5s。c.qRT-PCR采用SYBR Green荧光染料法进行实时定量PCR扩增的检测。PCR反应体系为20ul,其中2×SYBRpremixEXTaq TM10ul,上下游引物各0.4ul (10umol/L)、cDNA2ul, dH207.2ul。于实时定量PCR仪分别进行TXNIP和β-actin的PCR反应,扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸10s,45个循环后,72℃延伸10min。反应过程中同时设阳性对照,以水替代cDNA为阴性对照。TXNIP mRNA相对表达量采用2-△CT进行计算,ΔCT=CTTXNIP-CTβ-actin。(所用的TXNIP引物序列：上游5’-GACTTCGGAGTACCTGCGCTATG-3’,下游5’-AAGCTCAAAGCCGAACTTGTACTCA-3’,所用的β-actin引物序列：上游5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’,下游5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3’)。B.western blot检测TXNIP蛋白表达a.提取总蛋白乳腺癌组织和对应癌旁组织,剪碎,PBS洗涤3遍,液氮中研磨,最后加入200ul的蛋白裂解液冰浴裂解,抽提组织细胞总蛋白。b.按50ug/孔上样,在10%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离,湿转法将蛋白质从SDS-PAGE凝转移至PVDF膜,在含5%脱脂奶粉的TTBS中室温封闭90min,加入一抗(兔抗人TXNIP抗体,稀释度为1：200),4℃孵育过夜,TTBS充分漂洗(10minx3次),加入二抗(羊抗兔IgG,即用型),37℃作用40min, TTBS充分漂洗(10min×3次),化学荧光法(ECL)显色,压片,显影,定影,观察结果。C.免疫组织化学法a.采用免疫组化SP法,乳腺癌及配对的癌旁乳腺组织切片常规脱蜡水化,置入0.01mol/L的柠檬酸缓冲液中,用微波修复法进行抗原修复,冷却至室温,3%的H202阻断内源性过氧化物酶,孵育15min, PBS冲洗3次,每次3min,滴加山羊血清封闭液,室温下孵育25mmin,滴加50ul兔抗人TXNIP单克隆抗体(1：100),4℃孵育过夜,PBS冲洗5次,每次5min,滴加50ul二抗,室温孵育45min, PBS冲洗5次,每次5min,DAB显色1～3min,苏木素复染,常规脱水透明,中性树胶封片。同时设置阴、阳性对照。b.半定量结果判断免疫组化染色,无棕黄色为0分；淡棕黄色为1分：棕黄色为2分；棕褐色为3分。同样物镜下观察阳性细胞数,无阳性细胞数为0分；阳性细胞数≤10%为1分；阳性细胞数11%～50%为2分；阳性细胞数>50%为3分。将染色深度和阳性细胞数百分比的得分相乘,2分及以上为阳性。c.统计学处理采用SPSS13.0软件进行处理。数据采用均数±标准差表示,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,P<0.05有统计学意义。三、结果1. qRT-PCR检测TXNIP mRNA水平组织标本提前的RNA完整性好。经过检测16例乳腺癌组织与对应癌旁组织中TXNIP的mRNA表达水平,发现TXNIP的mRNA的平均水平在乳腺癌组织(39.07±12.34)与对应癌旁组织中(40.12±13.13)无明显差异(P>0.05)。2. western blot检测TXNIP蛋白表达水平同时我们随机选取了7例乳腺癌与对应癌旁乳腺组织样品,免疫印迹分析它们之间TXNIP的表达水平差异,发现在5例样品中,TXNIP蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量低于正常癌旁组织中的相对表达量(图1.A-E),而在另2例样品中,TXNIP的蛋白质相对表达量没有明显变化(图1.F-G),TXNIP蛋白在乳腺癌组织中的表达灰度值为0.43±0.11,明显较对应的癌旁组织的0.85±0.01低(P<0.05)(图1)3.免疫组化检测TXNIP在乳腺癌组织中的表达水平A. TXNIP在乳腺癌和乳腺癌癌旁组织中的表达两者均有表达,其阳性染色呈棕黄色弥漫染色或颗粒状主要分布于细胞质,部分细胞核也有表达。在乳腺癌癌旁组织中的阳性表达率为72.00%,乳腺癌中的阳性表达率为52.00%,差异有显著性,P<0.05(图2-4)。B. TXNIP和乳腺癌临床病理特征的关系Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌TXNIP蛋白的阳性表达率为80.00%,Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌TXNIP蛋白的阳性表达率为33.33%,Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的TXNIP蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05),Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌配对的癌旁组织TXNIP蛋白阳性表达率为85%,Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌及其配对的癌旁组织TXNIP蛋白表达水平无显著差异,Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌配对的癌旁组织TXNIP蛋白阳性表达率为63.33%,Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌及其配对的癌旁组织TXNIP蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05)；中高分化乳腺癌TXNIP蛋白的阳性表达率为73.07%,低分化乳腺癌TXNIP蛋白的阳性表达率为29.16%,中高分化和低分化乳腺癌的TXNIP蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05),中高分化乳腺癌配对的癌旁组织TXNIP蛋白阳性表达率为73.07%,中高分化乳腺癌及其配对的癌旁组织TXNIP蛋白表达水平无显著差异,低分化乳腺癌配对的癌旁组织TXNIP阳性表达率为70.83%,低分化乳腺癌及其配对的癌旁组织TXNIP蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05)。四、结论1、TXNIP的表达水平和TXNIP蛋白表达水平不在乳腺癌组织与对应癌旁组织中,TXNIP mRNA一致。2、TXNIP蛋白表达水平和乳腺癌的临床分期、组织学分化相关,分期越早,分化程度越高,TXNIP蛋白表达水平也越高,这提示TXNIP蛋白可能是一个有价值的抑癌分子。