恒定链（Invariant chain,Ii）具有重要的免疫调节作用,其在细胞内的定位与功能密切相关,如在内吞体中,Ii对抗原及其转运分子的加工和递呈具有重要作用。Rab5a和Rab7b分别是不同时期内吞体间的主要转运蛋白。课题组前期研究发现二者均可以在内吞体中与Ii共定位和结合,然而Ii与它们结合和共定位的功能结构域尚不清楚。为此,本实验以鸡Ii为研究对象,主要进行了以下两个方面的研究。第一,明确鸡Ii与Rab5a和Rab7b分子在细胞内吞体共定位的关键结构域。首先,利用PCR和基因突变技术将鸡Ii的胞浆区与跨膜区(Ii（Cyt-Tra）)、CLIP（ClassⅡ-associated invariant chain peptide）与三聚体区(Ii（CLIP-TRIM）)和Ii-CLIP突变体(IiM81-87aa、IiM91-99aa和IiM81-99aa)基因片段定向插入到p EGFP-C1载体中,构建重组真核表达质粒。其次,将构建的真核重组质粒转染293T细胞,应用荧光显微镜观察Ii不同结构域在细胞内定位。最后,带有绿色荧光蛋白的重组质粒分别与带有红色荧光标签的重组质粒（pm Cherry-C1-c Rab5a或pm Cherry-C1-c Rab7b）共转染293T细胞,应用免疫印迹法和激光共聚焦鉴定他们在真核细胞内的蛋白表达和共定位。结果表明,克隆获得的目的基因与预期大小一I致I,并正确构建重组真核表达质粒。Ii-CLIP突变体及其Ii（Cyt-Tra）均能与Rab5a或Rab7b在细胞内吞体共定位,却不与Ii（CLIP-TRIM）和空载体共定位。说明Ii的胞浆区和跨膜区是Ii与Rab分子共定位的关键结构域而不是Ii的CLIP区。缺失Ii的CLIP结构域影响Ii在细胞内的定位。第二,明确了鸡Ii与Rab5a和Rab7b结合的关键结构域是胞浆区和跨膜区。首先,将Ii不同结构域和Rab5a（Rab7b）的基因片段分别构建到含有His和GST标签的原核表达载体中,构建重组原核表达质粒。其次,将构建的重组质粒转化Rosetta（DE3）进行蛋白的表达,分别利用两种亲和层析柱进行蛋白的纯化。最后,应用Pull-down和免疫印迹法检测含Ii不同结构域的重组蛋白分别与Rab5a和Rab7b的结合。结果显示,正确构建相应原核重组表达菌,并能进行蛋白的表达和亲和层析纯化。Pull-down试验表明鸡Ii（Cyt-Tra）是结合Rab5a或Rab7b的主要结构域,而CLIP和三聚体区与此结合无关。总之,Ii的胞浆区和跨膜区是与Rab5a和Rab7b胞内共定位和结合的关键结构域,尽管CLIP影响Ii胞内定位,却不影响Ii与Rab分子的结合。这一发现,为进一步阐述Ii细胞内转运机理并为Ii载体的应用提供了理论基础。