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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一些植入性医疗器械的主要定植菌,常见于囊性纤维化肺炎患者,通常会产生滞留性感染。滞留菌是细菌内种群的表型异质性细胞亚群,它们通过降低自身代谢活性,减少ATP合成等多种方式失活抗生素在细胞内的作用靶点,是病原菌躲避宿主免疫清除和抗生素治疗的一种自我防御模式。更加棘手的是滞留菌在去除抗生素后可以自我恢复,重新建立病灶,导致感染性疾病的复发。临床上铜绿假单胞菌滞留菌引起的慢性感染与疾病的复发日益严峻,同时增加了耐药菌产生风险,因此滞留菌耐药机制的深入研究与新型抗滞留菌药物和治疗策略的研发刻不容缓。抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMP）是一类具有广谱抗菌和免疫调节活性的多功能活性肽,能够在短时间内快速杀灭细菌。其特殊的膜作用靶点,使抗菌肽区别于传统抗生素,具有低药物相互作用、不易诱导耐药性等特点,因此以抗菌肽及其衍生物作为潜在的治疗滞留菌感染的新型药物。含色氨酸抗菌肽I1W和L12W是以本实验室前期分离纯化的中国林蛙（Rana chensinensis）皮肤分泌的天然抗菌肽Temporin-1CEb为模板设计合成的,对细菌细胞膜的破坏作用效果更好。本论文主要研究含色氨酸抗菌肽I1W和L12W对多药耐药铜绿假单胞菌滞留菌细胞膜和氧化应激反应的影响。自然条件下细菌种群形成的滞留菌的数量不足1%,并且极其不稳定。为了更好的研究抗菌肽对滞留菌的作用,首先以利福平作为诱导剂,诱导一株临床上分离得到的多药耐药铜绿假单胞菌株（multiple-drug resistant Pseudomonas aeruginosa 0108,MRPA0108）形成滞留菌。利福平在不同浓度和诱导时间诱导指数期MRPA0108产生滞留菌的实验结果显示:100μg/m L和200μg/m L利福平分别诱导指数期MRPA0108细菌3 h,得到滞留菌2.1×10~3CFU/m L和1.6×10~3CFU/m L;而100μg/m L和200μg/m L利福平诱导稳定期MRPA0108细菌3 h,得到的滞留菌数量为2.9×10~3CFU/m L和4.1×10~3CFU/m L,表明利福平诱导的稳定期MRPA0108可以产生更高数量的滞留菌。测定细菌的ATP水平结果显示:稳定期MRPA0108细菌的ATP水平明显低于指数期MRPA0108细菌的ATP水平,提示处于低代谢水平的稳定期MRPA0108细菌对利福平的敏感性更低,更容易诱导产生滞留菌。实验结果确定利福平诱导MRPA0108滞留菌形成的最佳诱导条件为200μg/m L利福平诱导稳定期MRPA0108菌株3 h。我们对利福平诱导的MRPA0108滞留菌的氧化应激反应进行了测定。结果显示:与未诱导的MRPA0108细菌相比,利福平诱导的MRPA0108滞留菌细胞内的活性氧（ROS）水平上升了40.1%,细胞发生过氧化的标志物丙二醛（MDA）含量增长了92.9%,而细菌内抗氧化酶活性显著下降,其中超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低了9.2%,过氧化氢酶（CAT）活性降低了19.4%,提示利福平作用后,MRPA0108细菌内抗氧化酶合成减少,直接影响了ROS的清除速率,ROS水平小幅度增加,使细菌进入休眠状态,这很有可能是利福平诱导产生MRPA0108滞留菌形成的原因之一。含色氨酸抗菌肽I1W和L12W对利福平诱导的MRPA0108滞留菌具有良好的抗菌活性。抗菌肽I1W和L12W对利福平诱导的MRPA0108滞留菌的抗菌活性与未诱导的MRPA0108相同,MIC分别为6.25μM和25μM。杀菌动力学实验结果显示抗菌肽I1W和L12W在8×MIC作用180 min时能够彻底杀死MRPA0108滞留菌。细菌内外膜通透性实验结果指出,抗菌肽I1W和L12W使MRPA0108滞留菌细胞内膜发生明显的去极化,同时显著增加了外膜的渗透性。激光共聚焦显微镜观察结果证实了抗菌肽影响了滞留菌细胞膜的完整性。此外,研究结果显示抗菌肽I1W和L12W对MRPA0108滞留菌的氧化应激能力有明显的影响,I1W和L12W处理MRPA0108滞留菌3 h后,SOD和CAT活性发生显著降低,ROS爆发并积累,MDA含量显著增加,表明I1W和L12W使MRPA0108滞留菌内发生了不可逆的氧化损伤,增加了滞留菌死亡速率。为了增加抗生素对处于代谢抑制状态的滞留菌表现出的较差抗菌活性,我们选择抗生素头孢吡肟、妥布霉素和环丙沙星与含色氨酸抗菌肽I1W和L12W联用,期望增加抗生素对滞留菌的抗菌活性。实验结果表明1×MIC的I1W与16×MIC的头孢吡肟或8×MIC的妥布霉素作用3 h可以彻底清除MRPA0108滞留菌。综上所述,利福平可以通过降低MRPA0108细菌抗氧化能力,导致ROS水平小幅度增加,降低细菌代谢,促进细菌进入休眠状态,从而诱导稳定期MRPA0108细菌产生滞留菌。含色氨酸抗菌肽I1W和L12W可以破坏MRPA0108滞留菌细胞膜完整性,也能够使细菌内ROS水平激增,打破细菌内氧化应激反应的平衡从而杀死MRPA0108及滞留菌。含色氨酸抗菌肽I1W和L12W与传统抗生素同时使用显著增加了抗生素对MRPA0108滞留菌的杀菌活性。