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李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)是一种在世界范围内广泛发生的病毒病原物,能够侵染危害多种核果类果树(如桃、樱桃、李、杏和油桃)和一些观赏植物(如玫瑰和百合)。尽管PNRSV的形态学及群体遗传结构等特征已有较深入的研究,但有关PNRSV中国和加拿大分离物的遗传多样性的研究却很少。因此本课题从系统研究PNRSV中国和加拿大分离物遗传多样性入手,建立了integrated-PCR用于鉴定区分PNRSV不同组群(或基因型)分离物。在此基础上,克隆测序两个PNRSV分离物Chr3和Pch12的基因组序列全长并成功构建了Chr3和Pch12侵染性cDNAs克隆。最后,对PNRSV的致病机理进行研究,并鉴定出PNRSV的致病因子。结果如下：1.采用RT-PCR对我国多种李属植物样品进行PNRSV检测,发现PNRSV的侵染率为31.3%。并克隆了10个PNRSV中国分离物的CP基因序列,序列分析表明其核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为88.4-100%和89.8-100%。序列多重比对和系统发育进化分析表明：17个PNRSV中国分离物(包括NCBI数据库已登录的7个)归属于PV96, PV32口PE5组群,分布频率依次为29.4%,58.8%和11.8%。最后,根据不同组群分离物CP基因核苷酸序列特征,建立了integreted-PCR用于鉴定区分不同PNRSV组群分离物。2.2010年10月-2011年6月,从加拿大安大略省Niagara Fruit Belt-农场采集69份核果类果树枝条或叶片样品(32份樱桃和37份桃树),采用DAS-ELISA和RT-PCR进行PNRSV检测。检测结果表明：18份桃树和13份樱桃样品感染PNRSV,感染率为44.9%,且PNRSV阳性和阴性果树样品无明显症状差异。并克隆测序了此31个分离物的基因组RNA3序列(包括5’端MP基因和3’端CP基因)。基于MP或CP基因的系统发育进化分析结果表明：此31个PNRSV分离物归属于PV96和PV32两大组群,其中以PV96为优势组群。据我们所知,本研究系首次在加拿大发现并鉴定PNRSV。3.采集Chr3和Pchl2感染的枝条样品,从其韧皮部组织提取总RNA。以随机引物反转录获得第一链cDNA,后分别用引物RNAs-R/RNA1-L,RNAs-R/RNA2-L和RNAs-R/RNA3-L进行PCR扩增(其中RNAs-R为简并引物,根据PNRSV基因组RNA1.RNA2和RNA3的3’-UTR保守区序列设计；RNA1-L,RNA2-L和RNA3-L为特异性引物,分别根据RNA1, KNA2和RNA3的5’-UTR特异序列设计)。扩增产物回收、克隆和测序后,获得近基因组RNA1, RNA2和RNA3全长序列。基因组5’端序列克隆采用5’-RACE试剂盒进行；3’端序列克隆采用3’-RACE试剂盒进行。序列组装,获得PNRSV分离物Chr3和Pch12的基因组全长序列(GenBank数据库收录号为：(N416771-JN416776),并分析基因组的结构及特征。4.将PNRSV基因组RNA1,RNA2和RNA3的全长cDNA分别克隆到双元植物表达载体pCass4-Rz的35S启动子和核酶(Rz)序列之间。农杆菌GV3101介导转染PNRSV草本寄主黄瓜(Straight Eight)。DAS-ELISA和RT-PCR检测结果表明：所有接种Chr3和Pch12克隆的黄瓜植株均感染PNRSV.感染Chr3黄瓜植株表现轻微黄化和坏死等症状,而感染Pch12黄瓜植株表现严重环斑、坏死和矮缩等症状。为明确所构建的Chr3和Pch12的cDNAs克隆能否感染其自然寄主,基因枪介导转染PNRSV自然寄主桃树(GF305&Loring)和樱桃(Bing)。DAS-ELISA和RT-PCR检测结果表明：所有接种Chr3和Pch12的樱桃植株均感染PNRSV。感染Pch12的樱桃植株表现矮化、坏死和叶芽坏死等严重症状,而感染Chr3的樱桃植株表现轻微症状-不规则形状坏死斑和轻微矮化。约1/4接种Pch12的桃树(GF305)感染PNRSV,感病植株呈现褪绿环斑等症状,后迅速坏死并脱落形成“穿孔”；约1/3接种的桃树(Loring)呈现轻微花叶症状(随着植物生长,花叶症状逐渐消失)。然而,接种Chr3的桃树(GF305&Loring)均未感染PNRSV。总之,本研究所构建的Chr3和Pch12的cDNAs克隆能成功侵染其草本寄主及相应自然寄主,并呈现不同致病性特点,即Pch12的致病性强于Chr3。5.为揭示Pch12和Chr3致病性差异的分子机理,我们通过互换Chr3和Pch12的基因组RNA1, RNA2或RNA3以及基因组不同区段,获得一系列杂合PNRSV病毒,致病性测定表明：RNAl的1C和RNA2的2M区段共同决定PNRSV致病性。以Pch12的侵染性cDNA克隆为背景,我们构建了7个源于1C和2M区段的单/双氨基酸替换的突变体,致病性测定结果表明：当2M区段的Lys279突变为Asn279,分离物Pch12致病性由强变弱；1C区段的氨基酸替换不改变Pch12的致病性。互补试验证实Pch12的强毒因子可赋予弱毒分离物Chr3强致病性。总之,PNRSV的基因组RNA1和RNA2共同决定PNRSV的致病性以适应不同的李属寄主。