背景我国成人腰痛即时患病率高达26.1%,严重影响人民生活质量和经济生产。大量研究表明,腰椎间盘退变是引起腰痛的重要病因。现有研究多着重于椎间盘退变机制,而对椎间盘退变病理过程中所伴随的神经生物学影响研究甚少。目前认为,退变椎间盘内的炎症反应能激活痛觉传导通路,将疼痛信号传入脊髓,从而产生腰痛感知。广泛认为,腰痛类似于神经病理性疼痛,后者主要见于神经系统原发性损害所引起的长期慢性疼痛。已知在神经病理性疼痛中,中枢神经系统内的小胶质细胞发挥重要作用。有研究提示椎间盘退变可能引起中枢神经系统内小胶质细胞活性改变,但具体改变的内容和机制尚未阐明。本研究改良现有的腰椎间盘退变动物模型,探讨椎间盘退变病程中脊髓小胶质细胞代谢变化情况,并进一步探究椎间盘退变对脊髓小胶质细胞活性变化产生影响的相关机制,以期为椎间盘源性腰痛的临床治疗提供新的线索和思路。方法1.选取38只2-3月龄雄性CX3CR1GFP/+转基因小鼠,随机分为椎间盘穿刺组(19只)和假手术组(19只)。术前两组各取3只小鼠作为空白对照。改良已有的小鼠椎间盘穿刺手术方法,对椎间盘穿刺组内的16只小鼠经微创后外侧入路行L3/4椎间盘穿刺;对照组内16只小鼠以同样手术方式仅暴露L3/4椎间盘而不穿刺。分别在术后1、2、3、4周收集两组L3/4椎间盘组织、腰髓组织和L3背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)。2.通过椎间盘组织染色方法比较两组椎间盘组织变化情况;荧光显微镜观察腰髓切片中小胶质细胞数目和形态变化,初步探讨椎间盘退变对脊髓小胶质细胞的影响。3.运用Imaris软件对脊髓后角区域小胶质细胞行体视学(Stereology)分析。分析对比各时间点中实验组和对照组小胶质细胞数目,量化分析、对比两组小鼠脊髓中小胶质细胞的细胞结构(包括细胞指数、细胞突起长度、胞体体积等)。4.利用免疫染色技术观察DRG内巨噬细胞集落刺激因子1(Colonystimulating factor 1,CSF1)及脊髓内 CSF1 受体(Colony stimulating factor lreceptor,CSF1R)蛋白表达情况,探讨椎间盘退变中小胶质细胞活化的分子机制。结果1.椎间盘穿刺术引发椎间盘进行性退变,具体表现为纤维环纤维排列疏散,髓核周围蛋白基质充填减少,椎间隙狭窄以及髓核细胞向软骨细胞化生等组织学改变。2.椎间盘穿刺术后1-4周各时间点均可观察到脊髓后角小胶质细胞聚集现象,小胶质细胞聚集范围仅限于腰段脊髓。脊髓后角小胶质细胞聚集在穿刺术后第2周达到高峰,此后逐渐减弱消退,但在术后4周仍显著高于对照组。而假手术组小鼠脊髓后角小胶质细胞密度在各观察时间点中无显著变化。各观测时间点中,椎间盘穿刺小鼠脊髓后角小胶质细胞数目均高于假手术组(术后第1周:穿刺组12.3±0.77个,假手术组6.47±0.27个;术后第2周:穿刺组14.93±1.14个,假手术组7.02±0.62个;术后第3周:穿刺组10.09±0.55个,假手术组6.59±0.30个;术后第4周:穿刺组8.76±0.40个,假手术组6.37±0.34个,p<0.01)。术后各观察时间点体视学分析结果显示,穿刺组小鼠的小胶质细胞较对照组小胶质细胞呈现更大的胞体体积,较短的细胞突起和较小的细胞形态指数;同时穿刺组的小胶质细胞突起分支复杂度和细胞区域均较对照组小胶质细胞明显降低(p<0.01)。假手术组小鼠在术后各时间点所测得体视学参数(细胞指数、细胞突起长度、胞体体积等)结果与其术前均无统计学差异(p>0.05)。4.与假手术组相比,椎间盘穿刺组L3DRG内的降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)阳性感觉神经元中CSF1表达显著上调;相应地,脊髓后角小胶质细胞CSF1R的表达也显著升高,并且上调的CSF1R仅表达于小胶质细胞。结论1.改良的后外侧入路椎间盘穿刺术可诱发椎间盘出现进行性退变。该手术方式简单、微创、对腹部干扰少,可用于椎间盘退变和腰痛行为学研究。2.椎间盘退变可诱发小鼠小胶质细胞聚集于脊髓后角,主要位于后角浅层区域;并且,小胶质细胞聚集具有节段的对应性,仅出现在腰段脊髓。3.椎间盘退变活化脊髓后角小胶质细胞,表现为小胶质细胞胞体体积增大,细胞形态指数和细胞突起长度减小,细胞突起分支复杂度降低,细胞所占区域范围缩小;而小胶细胞的活化可能与腰痛相关。4.椎间盘退变可引起DRG内CSF1蛋白和脊髓小胶质细胞中CSF1R蛋白表达上调,提示椎间盘损伤与退变可能通过CSF1/CSF1R通路激活小胶质细胞,进而引起中枢敏化。