三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国沿海地区重要的海水养殖经济蟹类之一,在我国海洋捕捞对象中占据重要的地位。当前,三疣梭子蟹人工养殖规模在逐渐扩大,但在规模化养殖过程中出现了三疣梭子蟹性腺发育不良、个体偏小等问题,优质的三疣梭子蟹产量不能满足人们的需求。近年来,人们越来越重视三疣梭子蟹繁殖发育调控机制的相关研究,而性腺是繁殖发育的重要器官,承担着繁殖后代的重任,有众多调节因子参与了配子发生过程的调控。DNA甲基化修饰作为表观遗传重要组成部分之一,在真核生物生长发育中有重要的功能。本实验将从DNA甲基化角度初步研究DNA甲基化对三疣梭子蟹性腺、胚胎和幼体发育的调控机制,为深入研究三疣梭子蟹繁殖发育提供参考。主要研究结果如下:1.三疣梭子蟹性腺、胚胎和幼体DNA甲基化水平分析为了更直观的了解DNA甲基化在三疣梭子蟹发育中的作用,我们采用Methylflash方法分析了三疣梭子蟹性腺、胚胎和幼体发育不同时期的DNA甲基化水平。结果显示,卵巢发育不同时期DNA甲基化的水平大约0.005%-0.07%,DNA甲基化在卵巢发育不同时期都存在。其中,VI期卵巢的DNA甲基化水平最高,V期甲基化水平次之,显著高于卵巢发育其它时期(P<0.05)。胚胎发育时期,胚胎DNA甲基化的水平在0.008%-0.08%,DNA甲基化的水平呈现先下降后上升的趋势,在受精卵和无节幼体时期的DNA甲基化的水平最高,在囊胚期甲基化的最低。而在幼体发育阶段,DNA甲基化的水平呈现先下降后上升的趋势,在蚤状幼体I期的甲基化水平最高(P<0.05)。结果表明,DNA甲基化在性腺、胚胎和幼体发育中有重要的作用。2.三疣梭子蟹甲基化基因Dnmt2,Dnmt3b,UHRF1,MBD2,MBD4克隆及其在性腺、胚胎和幼体发育不同时期的表达分析为了研究DNA甲基化相关基因Dnmt2、Dnmt3b、UHRF1、MBD2和MBD4在三疣梭子蟹性腺、胚胎和幼体发育中的作用。本实验利用RACE技术克隆了上述5个基因的cDNA全长,同时利用Gene Tool,MEGA等软件进行了序列分析,同源性分析和进化树分析,结果显示:上述5个基因在进化上相对保守,与其它物种的同源性在55%-60%。其中三疣梭子蟹Dnmt2氨基酸序列和罗氏沼虾中的Dnmt2进化关系最近,Dnmt3b和UHRF1氨基酸序列同中华蜜蜂和桃蚜的进化关系最近,而MBD2和MBD4氨基酸序列则和端足虫进化关系最近。三疣梭子蟹各组织表达分析结果显示,5个基因在肝胰腺、性腺、胸腺、鳃、脑神经节、肠道、肌肉等组织中均有表达。Dnmt2,Dnmt3b和MBD4在卵巢中的表达量显著高于其它组织的表达(P<0.05)。对三疣梭子蟹甲基化基因Dnmt2,Dnmt3b,UHRF1,MBD2,MBD4卵巢组织不同时期的表达情况分析后表明,各基因在卵巢发育不同时表达差异显著。Dnmt2,UHRF1,MBD4三个基因在卵巢发育不同时期的表达趋势基本一致,都为先上升后下降,而Dnmt2和MBD2基因的表达量呈现逐渐上升的趋势,在V期的表达量达到峰值,在VI期的表达量最低。对上述5个基因在三疣梭子蟹精巢组织不同时期的表达情况分析发现,在精巢I-IV期,Dnmt2的表达量呈现逐渐上升趋势,在IV期表达量达到峰值并显著高于其它时期(P<0.05)。而UHRF1基因在精巢不同时期的表达发现,UHRF1的表达量则呈现逐渐递减的趋势,在I期的表达量显著高于其它时期(P<0.05)。MBD2和MBD4在精巢发育不同时期的表达趋势基本一致,在II期的表达量达到峰值,之后逐渐下降。利用Real-time PCR分析了Dnmt2,Dnmt3b等5个甲基化相关基因在三疣梭子蟹胚胎和幼体中表达情况。其中在早期胚胎时期,Dnmt2在受精卵和多细胞期没有表达,从囊胚期开始表达,且表达量逐渐上升,在无节幼体时期表达量最高。在大眼幼体时期Dnmt2的表达量较蚤状幼体IV期有所上升,但在大眼幼体末期第五天,其表达量明显下降。Dnmt3b在胚胎时期的表达和Dnmt2的表达趋势相似,在受精卵和多细胞时期无表达,在囊胚期的表达最高,之后逐渐下降,在蚤状幼体各时期的表达量基本一致,比大眼幼体时期的表达量较高。在早期胚胎发育阶段,UHRF1基因呈现先下降后上升的趋势,在受精卵时期的表达显著高于其它时期(P<0.05),。在幼体时期,UHRF1的表达呈现先上升后下降的趋势,在溞状幼体II和大眼幼体第三天,UHRF1的表达量最高并且显著高于同一时期的其它组织(P<0.05)。MBD2和MBD4则在胚胎发育中呈现先上升后下降的趋势,结合MBDs的功能,推测其在胚胎发育前期对相关基因的表达抑制能力增强。而MBD2和MBD4在溞状幼体阶段的表达量比大眼幼体阶段的表达高,表明这两个基因对溞状幼体阶段生长发育有调节作用。