论文部分内容阅读
肺动脉高压（Pulmonary Artery Hypertension,PAH）是指由多种病因所致肺血管床病变的基础上,肺循环阻力进行性增加,心导管检查平均肺动脉压静息状态下＞25 mmHg/或运动时＞30 mmHg,而肺毛细血管楔压≤15 mmHg的一类病理生理综合征。研究发现,肺毛细血管前阻力血管尤其是肺细小动脉的重塑是导致肺循环阻力和肺动脉压力进行性增加的主要因素,其主要病变之一是肺血管平滑肌细胞（Smooth Muscle Cell,SMC）增殖朋巴大、凋亡的失衡、细胞迁移以及细胞外基质合成、降解的异常,引起肺肌性细小动脉中膜肥厚、无肌细小动脉肌化,导致肺毛细血管前阻力血管管腔狭窄、闭塞,肺血管床面积减少,使肺循环阻力增加,从而引起肺动脉压持续增高和进行性恶化,最终致患者右心衰竭而死亡。因此,对人或实验动物肺血管SMC的分离和培养,是PAH发病机制研究中一种重要的体外细胞实验模型。内皮素-1（endothelin-1,ET-1）是新近研究较多的与肺血管重塑可能密切相关的一强缩血管多肽,其在PAH患者肺动脉中浓度显著升高,且与PAH的严重程度和预后密切相关,ET-1主要由肺血管内皮细胞合成,但肺血管SMC也具有合成和分泌ET-1的能力。在炎性因子的刺激下,血管SMC分泌ET-1的能力可上升100倍之多,达到血管内皮细胞的分泌水平。ET-1与其特异性的两个受体ETAR和ETBR结合,调节肺血管的收缩和舒张,此外,研究发现ET-1还可能诱导肺血管SMC增殖/月巴大、抗凋亡和向周围迁移,在PAH的发生和发展过程中可能发挥着重要的作用,因而我们推测PAH时异常升高的ET-1也许通过诱导肺细小动脉SMC增殖/月巴大与凋亡之间的失衡来参与肺细小动脉重塑的过程。为此,本课题拟在体外分离和培养大鼠肺细小动脉平滑肌细胞（RatPulmonary Arterial Microvascular Smooth Muscle Cells,RPMC）和大鼠肺大中动脉平滑肌细胞（Rat Pulmonary Large Arterial Smooth Muscle Cells,RPLC）,检测并比较两种细胞的增殖特性:在成功建立RPMC体外细胞培养模型的基础上,将ET-1基因瞬时转染RPMC,探讨过表达ET-1对RPMC增殖朋巴大和凋亡的影响及其可能信号转导机制。第一部分大鼠肺细小动脉和大动脉平滑肌细胞的分离培养及其增殖特性的比较目的:探讨体外分离和培养RPMC和RPLC的方法,并对两种细胞的生长和增殖特性进行比较。方法:SD大鼠麻醉后经右心室向肺动脉插管,依次灌注PBS、胰蛋白酶液、低融点琼脂糖和三氧化二铁混悬液,同时行气管插管并灌注低融点琼脂糖,夹闭左心房、肺动脉和气管,完整取下心肺组织置于预冷的DMEM不完全培养液中至琼脂糖凝固;沿胸膜下1 mm处剪下肺组织,在解剖显微镜下剔除动脉直径＞200μm的肺组织,剩余组织经剪切后放入Ⅳ型胶原酶中孵育;充分冲洗后再次剪切,用含20%胎牛血清的DMEM液混悬,并接种至预涂明胶的6孔板中培养。另取大鼠同上法麻醉后经右心室向肺动脉插管,依次灌注PBS、胰蛋白酶液,在解剖显微镜下分离大鼠肺大中动脉,Ⅳ型胶原酶消化外膜后,用组织块贴壁法培养。用细胞免疫荧光法和电镜进行培养细胞鉴定,用MTT法检测RPMC和RPLC细胞的增殖情况并绘制生长曲线,用流式细胞技术对两种细胞作细胞周期分析。结果:3-5 d可见RPMC自组织块周围爬出,而RPLC则在7-14 d左右爬出;RPMC和RPLC生长融合时均为长梭形,并呈培养的SMC特征性的“峰—谷”状生长方式;细胞免疫荧光法观察到SMC特征性的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）的表达;电镜也观察到其特征性的肌丝、密体和密斑;第3代培养细胞纯度均超过95%。MTT结果显示,RPMC的生长速度明显快于RPLC,在第4d时差异有统计学意义。流式细胞技术结果显示,与RPLC相比,RPMC中处于S期和G2/M期的细胞比例增高,细胞增殖指数升高。结论:本实验为RPMC原代培养提供了一种切实可行的方法,并证实RPMC和RPLC的增殖特性之间存在差异,为体外实验研究存在于肺细小动脉中膜SMC病变的肺相关疾患,尤其是在对PAH发病机制的研究中,提供了更为直接、可靠的一种体外细胞研究模型。第二部分内皮素-1过表达对大鼠肺细小动脉平滑肌细胞凋亡的影响及可能作用机制目的:探讨过表达ET-1对体外培养的RPMC凋亡的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。方法:三氧化二铁肺动脉灌注法体外分离和培养原代RPMC,重组真核表达质粒pMEXneo-ET1和pCDNA5-FRT-TO-ET1-3’UTR及其空载脂质体介导法瞬时转染RPMC并经实时荧光定量RT-PCR法和免疫印迹法鉴定后,用实时荧光定量RT-PCR法检测ET-1过表达对其受体ETA和ETB含量的影响,用流式细胞技术检测细胞凋亡的改变,并用免疫印迹法检测丝/苏氨酸蛋白激酶（Akt/PKB）的磷酸化水平和剪切的半胱天冬酶-3（Caspase-3）的水平变化。结果:瞬时转染的效率约为25%左右;瞬时转染RPMC 48h后,ET-1 mRNA表达分别为空载转染组的28.5倍和21倍,ET-1蛋白的表达分别为空载转染组的6.7倍和4.5倍;RPMC中ETA受体mRNA表达水平明显高于ETB受体。转染后RPMC中ETA受体与ETB mRNA表达水平均增高,但两者的比例保持不变:流式细胞技术结果显示,空载转染组RPMC凋亡的比例分别为10.99%和12.66%,转染组RPMC凋亡的比例为5.0%和4.1%,呈明显下降。免疫印迹法检测显示,过表达ET-1后,转染组RPMC的Akt/PKB的磷酸化水平升高,剪切的Caspase-3的表达水平下降。结论:ET-1可能经Akt/PKB-Caspase-3信号通路抑制RPMC的凋亡,从而在PAH的血管重塑过程中发挥着重要作用。第三部分内皮素-1过表达对大鼠肺细小动脉平滑肌细胞肥大特性的影响及可能信号转导机制目的:探讨过表达ET-1对体外培养的RPMC增殖/肥大的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。方法:三氧化二铁肺动脉灌注法体外分离和培养原代RPMC,重组真核表达质粒pMEXneo-ET1和pCDNA5-FRT-TO-ET1-3’UTR及其空载脂质体介导法瞬时转染RPMC并经实时荧光定量RT-PCR法和免疫印迹法鉴定后,用流式细胞技术检测细胞周期和细胞体积的变化,用免疫印迹法和细胞免疫荧光法检测α-SMA的表达,同时检测细胞总蛋白/总DNA比的变化。并用免疫印迹法检测雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）的磷酸化水平。结果:与空载相比,转染48h后RPMC细胞周期分布和细胞增殖指数未见明显差异,但转染72h后检测到α-SMA合成功能增强,分别为空载转染组的1.3和1.2倍,细胞总蛋白/总DNA比也增高,分别为空载转染组的1.6和1.5倍。流式细胞术检测显示,与空载相比,转染72h后RPMC细胞体积增大,分别为空载转染组的1.1倍和1.2倍。免疫印迹法检测显示,转染48h后,Akt/PKB和mTOR的磷酸化水平升高,ERK1/2的磷酸化水平降低。结论:过表达ET-1可能经Akt/PKB-mTOR信号通路诱导RPMC肥大,从而可能在PAH的血管重塑过程中发挥着重要作用。