研究背景和目的造血过程是受一系列因子精确调控、由造血干细胞(hemopoieticstem cell, HSC)定向分化为不同的细胞系，并进一步形成成熟细胞的过程。造血干细胞又称多能干细胞，是存在于造血组织中的一群原始造血细胞。来源于造血干细胞的多能祖细胞（Multi-Potent Progenitor，MPP）则不再具有自我更新能力，但保留完整的谱系分化潜能。再往下游，MPP分化为寡潜能祖细胞（Oligo-Potent Progenitor），如：1）淋巴祖细胞（Common lympoid progenitors, CLP）和2）髓系祖细胞（Common myeloid progenitors,CMP）。然后再由寡潜能祖细胞分化为具有定向分化特点的祖细胞，例如CMP可继续分化为粒系-巨噬系祖细胞(granulocyte-macrophage progenitors,GMP)和巨核系-红系祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitors, MEP)。在复杂精密的造血过程中，大量转录因子调控造血细胞的增殖与分化。如果该过程发生异常，则会引起血液系统的一系列疾病，甚至引起白血病。Evi1(ecotropic virus integration site-1)基因对造血系统多个细胞系的分化过程均有影响，该基因最初是在AKXD模式小鼠粒系白血病中发现的逆转录病毒结合位点，在骨髓增生异常综合症（MDS）和急性粒细胞白血病（AML）等白血病病人标本中可以检测到该基因的表达。据报道正常人血液系统内并无Evi1基因的表达，而Evi1基因的高表达可以导致骨髓内未成熟细胞增多、造血功能衰竭、无效造血和贫血。现已明确Evi1基因定位于MDS病人中常见的3q21q26综合症断裂位点处，该基因的异常表达可促进MDS疾病进展为白血病。miRNA是一类内源性小分子RNA，其长度为21~24nt，多通过结合至靶基因mRNA3UTR区在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA的表达具有时序性和组织特异性，因其在生物发育的不同阶段及不同组织中表达类型不同，所以miRNA可能具有复杂多样的生物学功能。另外，miRNA与靶基因之间及不同miRNA之间可以构成一个复杂的基因表达调控网络，同一种miRNA可参与调控多个靶基因的表达，而同时几种miRNA可能作用于同一个靶基因。在造血过程中，miRNA参与其中的重要环节，而在此过程中一些异常表达的miRNA的功能也已得到证实。叉头框（Forkhead box, Fox）蛋白质是螺旋-转角-螺旋类蛋白质超家族的一个亚群，具有结合DNA和转录活化、抑制等多种生物学功能。Fox蛋白家族包含有17个亚家族，但其中O亚型Foxo蛋白是该家族中重要成员。Foxo蛋白在哺乳动物中有四种亚型：Foxo1、Foxo3、Foxo4和Foxo6。该蛋白家族在细胞分化、DNA修复、应激抵抗及凋亡等方面均起重要作用。在造血系统中，Foxo1/3/4基因的丢失可以促进正常骨髓粒系细胞分化。课题组的前期研究已证实在Evi1的不恰当表达促进MDS或AML疾病的发生和发展过程中，Evi1可抑制造血干/祖细胞向粒系和红系细胞分化。在高表达Evi1的骨髓细胞中microRNA array结果显示包括miR9在内的多种microRNA基因表达水平发生变化，其中大部分miRNA在正常骨髓细胞分化中所起的作用并不清楚。miR9具有多种生物学功能，在不同肿瘤中所起的作用也不尽相同，但是对于miR9在血液系统中所起的作用及其机制鲜见报道。因此，本研究的主要目的是探讨：1）miR9对造血干/祖细胞的作用和机制；2）miR9参与Evi1诱导的白血病及其分子机理，为全面了解Evi1促进白血病的发病机制提供新的线索。方法1.构建逆转录病毒表达质粒： pre-miR9-migR1、Sponge-miR9-migR1、 Foxo3a-migR1、 Foxo3a+pre-miR9-migR1、pre-miR9-MSCV和Sponge-miR9-MSCV；构建荧光素酶报告基因质粒：pGL4.20-miR9promoter(-468+58)、pGL4.20-miR9promoter(-200+58)、pGL4.20-miR9promoter(-134+58)、 CDH1-pmiR、 NF-κB-pmiR、GSK3β1-pmiR、 GSK3β2-pmiR、 Foxo1-pmiR、 Foxo3-pmiR和SIRT1-pmiR；2.分离8周龄C57B/L6小鼠正常骨髓细胞，并经流式分选出：1）干细胞、各系祖细胞，包括造血干细胞(lineage-, Sca+, C-Kit+,LSK)、髓系祖细胞(Common myeloid progenitors,CMP)、粒系-巨噬系祖细胞(granulocyte-macrophage progenitors,GMP)和巨核系-红系祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitors, MEP)；2）各系成熟细胞，包括粒细胞（Mac1+/Gr1+）、红细胞（Ter119+）、B细胞（B220+）、T细胞（CD4+/CD8+）；采用Real-time PCR方法检测分选出来的干细胞、各系祖细胞及成熟细胞群中miR9三个前体亚型pre-miR9-1、pre-miR9-2和pre-miR9-3的表达水平以及成熟miR9的表达水平；3.给8周龄的C57B/L6小鼠腹腔注射5-FU，五天后分离骨髓细胞。用重组逆转录病毒MSCV、miR9和Sponge miR9(miR9抑制剂, sponge9)分别感染所获细胞后，采用G418筛选并通过软琼脂克隆、流式细胞学及涂片镜检观察这些病毒感染的骨髓细胞的增殖能力及其对粒系（Mac1+/Gr1+）分化的影响；4.给8周龄C57B/L6小鼠腹腔内注射5-FU后第五天分离骨髓干/祖细胞，并分别用重组Migr1、miR9和Sponge9逆转录病毒感染所获细胞。再经眼底静脉注射将这些细胞移植到经致死剂量射线(10Gr,20min)照射的5~6周龄小鼠体内。待2月后处死小鼠并分离其胸腺、脾脏和骨髓细胞：1）对各组织不同成熟细胞系进行染色，包括粒细胞、红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨核细胞和巨噬细胞；2）对骨髓细胞进行造血干细胞和髓系祖细胞染色；3）分别对骨髓干/祖细胞和成熟细胞进行Annexin V和DAPI染色；4）流式检测miR9对正常骨髓各系细胞分化及凋亡的影响；5. Real-time检测Kasumi、MV-40和U937白血病细胞系内pre-miR9表达谱并与正常骨髓细胞内pre-miR9表达谱进行比较，综合以上实验判断miR9是否参与造血干/祖细胞异常增殖分化，进展为白血病的过程。6. Evi1对miR9的影响及作用机制：1)给8周龄的C57B/L6小鼠腹腔注射5-FU，五天后分离骨髓细胞，用MSCV、Evi1逆转录病毒分别感染所获细胞，再在软琼脂上G418筛选培养18天，用Real-time PCR检测重组Evi1逆转录病毒感染的正常骨髓干/祖细胞内miR9的表达水平，以判断Evi1对miR9的影响；2)重组Evi1逆转录病毒感染293T细胞，用ChIP检测Evi1是否与miR9-3启动子特异结合，以判断两者间是否存在相互作用；3)电转pre-miR9-3基因启动子序列3种截短DNA片段的重组质粒pGL4.20-miR9promoter(-468+58)、pGL4.20-miR9promoter(-200+58)和pGL4.20-miR9promoter(-134+58)入小鼠3T3细胞，G418筛选获得稳定转染细胞系后，经荧光素酶报告基因分析Evi1和Dnmt3B是否对pre-miR9-3启动子区域产生影响；将pre-miR9-3基因启动子序列3种截短DNA片段的重组质粒pGL4.20-miR9promoter(-468+58)、pGL4.20-miR9promoter(-200+58)和pGL4.20-miR9promoter(-134+58)按不同分组分别与Migr1、Evi1、Dnmt3B及Evi1+Dnmt3B共同转染入293T细胞中，经双荧光素酶报告基因分析Evi1和Dnmt3B是否对pre-miR9-3特定启动子区域产生影响；7.给8周龄的C57B/L6小鼠腹腔注射5-FU，五天后分离骨髓细胞，采用磁珠分选的方法获得造血干/祖细胞群。用重组逆转录病毒MSCV、miR9、Evi1和Evi1+miR9分别感染所获细胞后，采用G418筛选及连续软琼脂克隆实验、流式细胞分析和涂片染色镜检，观察miR9是否能逆转Evi1基因抑制造血干/祖细胞粒系分化的作用；8. miR9下游靶基因的筛选鉴定：1）双荧光素酶报告基因检测miR9是否可结合至Foxo3、Foxo1、CDH1、NF-κB1、GSK3β、SIRT1等基因的3UTR区并调控其表达；2）Real-time PCR验证Foxo3、Foxo1、CDH1、NF-κB1、GSK3β、SIRT1是否在正常骨髓细胞中受miR9调控；3）Western blottting进一步验证Foxo3蛋白的表达是否受miR9调控；9.给8周龄的C57B/L6小鼠腹腔注射5-FU，五天后分离骨髓细胞，磁珠法分离获得造血干/祖细胞。用重组逆转录病毒migr1、miR9、Foxo3和Foxo3+miR9分别感染所获细胞并在体外液体培养三天后，经流式细胞学实验探讨单独表达miR9、Foxo3基因及共同表达miR9和Foxo3两种基因对正常骨髓细胞分化的作用。结果1.经测序证明6种重组逆转录病毒载体及10种重组荧光素酶报告质粒均构建成功；经流式细胞仪（FACS）证明4种带有GFP荧光标记的逆转录病毒感染骨髓细胞的效率达到40-60%，满足实验需要；利用这些载体工具，我们首先探讨了miR9在正常造血干/祖细胞增殖分化过程的作用。2.成功分离正常小鼠骨髓细胞，并经流式分选出各系祖细胞（LSK、CMP、GMP、和MEP）和各系成熟细胞（粒系、红系、B淋巴细胞和T淋巴细胞）。Real-time PCR检测发现：1）在骨髓各系细胞中miR9基因前体的三个亚型中以pre-miR9-3表达量最高；2）在骨髓各系细胞中，以粒系成熟细胞（Mac1+/Gr1+）中pre-miR9-3和成熟miR9表达量最高（p<0.001）。提示miR9-3可能在正常骨髓干/祖细胞粒系分化过程中起较重要的作用；3.成功分离骨髓干/祖细胞后：用MSCV、miR9和Sponge9感染骨髓干/祖细胞，进行连续软琼脂克隆试验。在第一个培养周期，感染miR9逆转录病毒的骨髓细胞克隆数和细胞数分别为（582±165）和（4.3±0.84×106），明显高于对照组的克隆数（87±5）和细胞数(0.82±0.37×106)，p<0.01；而感染sponge9逆转录病毒组的克隆数和细胞数分别为（98±13）和(0.93±0.19×106)与对照组相比无明显变化（p>0.05）；第二个培养周期，感染miR9逆转录病毒的骨髓细胞克隆数和细胞数（8±4）和(0.16±0.03×106)，与对照组克隆数（16±3）和细胞数（0.88±0.49×106）相比均明显减少（p<0.05），而sponge9组克隆数和细胞数分别为（23±5）和（1.36±0.32×106），与对照组相比无明显变化（p>0.05）。提示miR9促进早期造血干/祖细胞增殖和克隆形成，抑制晚期骨髓细胞增殖和克隆形成的能力。收集连续软琼脂克隆实验第二个培养周期的细胞，经流式细胞仪检测发现，在MSCV组、miR9组和Sponge9组成熟粒细胞（Mac1+/Gr1+）分别达到(37.8±5%)、(73.8±6%)和(28.6±3%)，miR9组较对照组增高95%（p<0.001），Sponge9组较对照组降低25%（p<0.05），表明上调miR9可促进骨髓干/祖细胞粒系分化，而下调miR9则抑制造血干/祖细胞粒系分化的作用；逆转录病毒感染的骨髓细胞涂片镜检发现：成熟粒细胞的细胞浆增多、淡染，核浆比例减少；MSCV、miR9和Sponge9三组的成熟粒细胞分别为（36±5%）、（73±10%）和(22±6%)； miR9组的成熟粒细胞较对照组增高103%（p<0.001），而Sponge9组的成熟粒细胞较对照组降低39%（p<0.05）。这进一步表明miR9具有促进骨髓干/祖细胞粒系分化的作用，而下调miR9则抑制造血干/祖细胞粒系分化的作用；本部分结果提示：miR9可能具有抑制造血干/祖细胞增殖、促进粒系分化的作用。4.将Migr1、miR9和Sponge9病毒感染的正常小鼠骨髓干/祖细胞移植入经致死剂量射线照射的小鼠体内，7周后处死小鼠并行干/祖细胞（LSK、CMP、GMP、和MEP）和各系成熟细胞（髓系、红系、B细胞和T细胞）及凋亡细胞染色，流式细胞学分析发现：1）miR9移植的小鼠骨髓内成熟B淋巴细胞占（10±3%），而对照组为（23±6%），miR9组较对照组相比降低57%（p<0.05）；2）miR9移植的小鼠骨髓和脾脏内红细胞、粒细胞、巨噬细胞及巨核细胞染色，流式细胞学实验表明：Vector、miR9和Sponge9组骨髓中成熟粒细胞（Mac1+/Gr1+）的百分比分别为32.4±4%，63.1±5%和5.81±3%，miR9组较对照组升高95%（p<0.001），而Sponge9组较对照组降低82%（p<0.001）；Vector、miR9和Sponge9组脾脏中Mac1和Gr1染色双阳性的细胞分别为13.8±2%，35.2±9%和6.3±2%，miR9组与对照组相比升高155%，而Sponge9组与对照组相比降低82%（p<0.01）。骨髓中，Vector, miR9和Sponge9组巨核系细胞（CD41染色阳性）分别为8.7±0.6%，53.1±8%和9±3%，miR9组与对照组相比，增高84%（p<0.001）；脾脏中，Vector, miR9和Sponge9组巨核细胞分别为9.6±0.8%，60±25%和17±6%，与Vector组相比，miR9组增高525%（p<0.05），而Sponge9组与对照组相比则无明显变化（p>0.05）。3）移植miR9的小鼠体内，骨髓干/祖细胞中凋亡细胞占12.3±2.3%，较对照组（2.6±0.4%）相比增高373%（p<0.001）；在全部骨髓细胞中凋亡细胞数占36.5±5%，与对照组（4.58±1%）相比增高657%，具有统计学意义（p<0.001）。移植及流式实验证明miR9在体内促进造血干/祖细胞髓系分化成熟、抑制B淋巴细胞成熟，并诱导造血细胞凋亡。由于白血病是起源于造血干/祖细胞异常分化的高度异质性疾病。因此，我们初步推测miR9可能参与造血干/祖细胞异常增殖分化、进展为白血病的过程。5.通过Real-timePCR检测急性粒细胞白血病细胞系Kasumi、B淋巴细胞/单核细胞系MV4-11和恶性淋巴瘤细胞系U937中pre-miR9表达谱。正常人骨髓标本中pre-miR9-3表达量较pre-miR9-1降低70%，Kasumi细胞系中pre-miR9-3表达量较pre-miR9-1增高810%， U937细胞系中pre-miR9-3表达量较pre-miR9-1增高100%，但MV4-11细胞系中pre-miR9-3表达量较pre-miR9-1并无明显变化。该结果进一步提示，miR9可能参与了白血病的发生发展。随后，我们继续探讨了miR9是否参与Evi1诱导的白血病及其分子机理。6. Evi1下调miR9表达的机制：1）Real-time PCR检测MSCV和Evi1逆转录病毒感染造血细胞内miR9的表达水平，发现Evi1组的成熟miR9为（0.06±0.04），明显低于对照组（1±0.4）(p<0.001)。这一结果与课题组前期microRNAarray结果一致；2）ChIP分析发现在293T细胞中的Evi1和Dnmt3B均可与pre-miR9-3启动子序列特异结合，提示两者间存在相互作用；3）将pre-miR9-3启动子序列三种DNA截短片段的pGL4.20质粒（pGL4.20-miR9promoter(-468+58)、pGL4.20-miR9promoter(-200+58)和pGL4.20-miR9promoter(-134+58)）分别转染入小鼠3T3细胞，经G418筛选获得稳定细胞系。经荧光素酶报告基因实验发现单独Evi1和Dnmb3B对pre-miR9-3启动子区域并无影响(p>0.05)；在以293T为研究载体的双荧光素酶报告基因实验中，单独Evi1和Dnmb3B对pre-miR9-3启动子并无影响(p>0.05)，而Evi1与Dnmt3B共转染组荧光素酶比值为（4.68±0.32），与对照组（9.86±0.11）相比降低约53%(p<0.05)。该结果提示Evi1可能通过招募Dnmt3B共同作用pre-miR9-3基因-200~-134启动子区域，并引起转录活性下降，最终致其表达降低；该部分结果提示：Evi1可能通过招募Dnmt3B结合至pre-miR9-3启动子序列-200~-134片段处，进而调控pre-miR9-3的表达。7.成功分离骨髓干/祖细胞；分别用MSCV、miR9、Evi1和Evi1+miR9逆转录病毒感染，再将所获得的细胞进行连续软琼脂克隆试验：1）第一次培养后，四组克隆数依次为（55±9）、（560±132）、（136±59）和（428±23）；2）第二次培养后，四组克隆数依次为（23±6）、（6±2）、（44±11）和（9±2）。分别收集第一次软琼脂克隆实验四组的细胞，经流式细胞学分析发现：这四组中成熟粒细胞的百分比依次为（34±7%）、（48±6%）、（22±3%）和（30±6%）。涂片染色镜检结果显示，四组未分化细胞所占百分比依次为（43±12%）、（28±6%）、（72±12%）和（52±9%）；由以上结果可知，miR9组克隆数减少、成熟细胞百分比增高(p<0.05)，而Evi1组克隆数增多、成熟细胞百分比减少(p<0.05)，但是Evi1+miR9组与对照组相比则差异不明显(p>0.05)。该实验结果提示：miR9可以部分逆转Evi1抑制造血干/祖细胞粒系分化的作用，这可能是miR9参与Evi1诱导白血病的分子机理。但是，miR9调控造血干/祖细胞分化的分子生物学机制还需进一步实验研究。8.通过双荧光素酶报告分析，我们发现：1）miR9可结合至Foxo3、Foxo1、CDH1、NF-κB1、GSK3β和SIRT1基因的3UTR区，miR9可能直接调控上述基因的表达(p<0.05)；2）Real-time PCR发现，在感染miR9的正常骨髓细胞内，Foxo3、Foxo1和NF-κB1基因的mRNA表达水平较对照组均有不同程度的下降(p<0.05)；3）Western blotting分析发现，感染miR9逆转录病毒的骨髓细胞内Foxo3蛋白水平下降。该部分结果表明Foxo3可能为miR9直接下游靶基因。9.分离骨髓干/祖细胞并分别感染Vector， miR9， Foxo3和Foxo3+miR9病毒后，通过流式细胞学分析得知：Vector，miR9，Foxo3和Foxo3+miR9四组间成熟粒细胞百分比分别为（9±3%）、（22±5%）、（7±2%）和（16±6%）。由以上结果可知，miR9组的成熟细胞百分比增高(p<0.05)，Foxo3组和Foxo3+miR9组的成熟细胞百分比均无明显变化(p>0.05)。提示：Foxo3可以部分逆转miR9促进造血干/祖细胞粒系分化的作用，Foxo3可能是miR9的直接下游靶基因。结论1.在小鼠正常骨髓造血过程中，miR9可能通过下调直接下游靶基因Foxo3的表达来抑制造血干/祖细胞增殖、促进小鼠干/祖细胞粒系、和巨核系分化、抑制B淋巴细胞分化，并且促进造血细胞凋亡；2. miR9参与Evi1诱导白血病的分子机制可能是：Evi1通过招募Dnmt3B并直接结合至miR9-3基因-200~-134启动子序列区，从而调控miR9的表达，实现其对造血系统的生物学作用。综上所述，Evi1-miR9-Foxo3轴在造血干/祖细胞异常分化为白血病的过程中起了重要作用，其机制可能是：Evi1异常高表达可以招募Dnmt3B并直接结合至pre-miR9-3基因-200~-134启动子序列区，下调miR9表达水平，因此miR9对下游靶基因Foxo3表达的抑制作用减弱，终致Foxo3的表达增高，最终引起造血干/祖细胞的异常增殖分化，促进白血病的发生发展。研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是致死率最高的癌症之一。对结直肠癌的分子病理学研究已经取得了可喜的进展，这对早期诊断、外科治疗和联合化疗都有很大的促进作用。然而，对于结直肠癌转移和/或耐药性结直肠癌的治疗手段有限，治疗效果不尽如人意。骨形态发生蛋白（bone morphology protein, BMP）信号通路的异常促进了可能发展为结直肠癌的幼年性息肉综合症的发病，这提示BMP信号通路可能在结直肠癌的发病中发挥了较为关键的作用。然而，该信号通路在散发性大肠癌病人中的作用并不十分清楚。本课题探讨了BMP2对人结直肠癌细胞系HCT116增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长能力等一系列的影响，试图为阐明BMP2对结直肠癌的作用提供实验依据。方法：1.构建过表达BMP2的腺病毒载体以及piggyBac转座子介导的稳定表达BMP2的载体。2.构建稳定表达BMP2的结直肠癌细胞系HCT116/BMP2-Fluc及其对照细胞系HCT116/Fluc。3.克隆形成实验：用Ad-BMP2、Ad-GFP感染HCT116细胞后检测细胞克隆形成能力。4.MTT实验：用Ad-BMP2、Ad-GFP感染HCT116细胞后检测细胞增殖能力。5.细胞划痕、迁移实验：用Ad-BMP2、Ad-GFP感染HCT116细胞后检测细胞迁移、侵袭能力。6.细胞凋亡实验：流式细胞仪检测HCT116/BMP2-Fluc及其对照细胞HCT116/Fluc凋亡情况。7.裸鼠皮下成瘤以及动物活体内光学成像：检测HCT116/BMP2-Fluc及其对照细胞HCT116/Fluc在裸鼠皮下的成瘤能力。8. IHC和HE染色：判断HCT116/BMP2-Fluc及其对照细胞HCT116/Fluc在裸鼠皮下形成的肿瘤中的细胞增殖能力。结果1.成功构建稳定细胞系HCT116/BMP2-Fluc及其对照细胞系HCT116/Fluc。2. BMP2抑制HCT116增殖：MTT实验结果显示，BMP2抑制HCT116细胞增殖并呈时间依赖性。其中，GFP组和BMP2组在第3天的测定值分别为1.07±0.14和0.768±0.18，它们在第4天的测定值分别是2.23±0.77和0.77±0.13，两组间差异显着，具有统计学意义(p<0.001)。克隆形成实验发现，感染BMP2腺病毒组形成的克隆数为(10±3)，明显低于GFP组(30±5)或空白组(p<0.001)，而GFP组与空白组之间无明显差异。该部分结果表明，BMP2可能抑制人结直肠癌细胞系HCT116的增殖能力。3. BMP2抑制HCT116细胞系迁移和侵袭：细胞划痕实验结果显示BMP2组与GFP对照组相比，迁移距离明显减少。在接种细胞后54小时，BMP2组划痕愈合率(60±12%)比GFP组(90±15%)降低33%，（p<0.01）。提示BMP2具有抑制HCT116细胞系迁移的作用。利用transwell实验，我们分析了BMP2对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。与预期结果一致，BMP2组通过小室的细胞数(18±5)比GFP组(38±6)降低53%(p<0.001)。该部分结果表明，BMP2具有抑制结直肠癌细胞侵袭的特性。4. BMP2诱导HCT116细胞凋亡：通过Annexin V和DAPI染色并经流式细胞学分析，发现HCT116/Fluc、HCT116/BMP2-Fluc两组细胞在完全培养基中生长良好，并无明显差异；但是，当在低血清（1%）培养基并培养72小时后，BMP2组凋亡细胞数达到42±6%，而GFP组凋亡细胞数仅为8±3%，两者间的差异有显着性(p<0.001)。5.BMP2抑制结直肠癌细胞系的成瘤能力：将HCT116-FLuc和HCT116-BMP2/FLuc细胞分别皮下注射到裸鼠体内，在第2周和第4周通过全身Xenogen生物发光仪监测肿瘤体积。我们发现，BMP2组在各时间点形成的肿瘤体积均较明显小于对照组，BMP2组的肿瘤体积约为对照组的26%(p<0.03)。H&E染色结果显示BMP2组的瘤体与对照组相比具有明显坏死灶；用PCNA抗体行免疫组化染色，发现BMP2组PCNA表达明显降低，这说明BMP2组肿瘤细胞的细胞增殖活性降低。结论：BMP2明显抑制结直肠癌细胞HCT116增殖、迁移，诱导细胞凋亡，并抑制HCT116体内成瘤能力。