樟芝深层发酵无性产孢金属离子促进剂的筛选及其胞内产物抑菌作用

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樟芝(Antrodia camphorata或Antrodia cinnamomea),又名牛樟芝、牛樟菇等,是一种珍稀药食两用真菌,具有抗癌、保肝、抗炎等功效。但野生樟芝生长缓慢,价格昂贵。深层发酵工艺具有发酵周期短、生产效率高等优点,是目前樟芝最主要的人工培养方式。然而,樟芝深层发酵过程仍然存在一些问题,如种子制备过程繁琐耗时,从而降低了生产效率及效益。本文通过筛选和优化能显著促进樟芝深层发酵无性产孢的金属离子来提高樟芝产孢量及产孢速度,从而提高樟芝无性孢子制备效率及生产效率;随后,利用RNA-seq等技术手段,分别对Fe2+处理组和对照组不同发酵时期的樟芝菌丝体样品进行转录组学等相关分析,预测了 Fe2+促进樟芝无性产孢的信号通路;最后考察了樟芝菌丝体及牛樟树提取物对常见食源性致病菌的抑制作用。本文主要内容如下:(1)筛选能显著促进樟芝深层发酵无性产孢的金属离子,并优化其最佳添加浓度。首先考察了不同金属离子对樟芝深层发酵无性产孢的影响,发现Ca2+、Fe2+及Zn2+均对樟芝无性产孢有显著促进效果,且最佳添加浓度分别为1.0 mmol/L、0.1 mmol/L及0.1 mmol/L;随后,用响应面法对Ca2+、Fe2+及Zn2+组合的最佳添加浓度进行了优化,发现各金属离子的最佳浓度分别为:0.149 mmol/L的Fe2+、2.01 mmol/L的Ca2+及0.135 mmol/L的Zn2+;在3种金属离子的最佳添加浓度下,可使樟芝深层发酵最大产孢量达8.67×107个/mL,较对照组提高133.62%,同时产孢量达到最大值的时间缩短了 24 h。(2)采用RNA-seq及生物信息学分析探究了 Fe2+促进樟芝深层发酵无性产孢过程的分子调控机制。首先,通过转录组学分析及数据库比对,在差异表达基因中比对到24个与铁离子吸收及产孢相关的基因,分别为mirB、ftrA、hapX、sreA、fet、bck1、uvt、urbs1、sit、fre、slt2、ssiG 06045、feoB、tpcA、nrps、nps2、nps4、clpP、mkk1、sidA、yvmB、fur、estB及wsc1;随后,通过进一步生物信息学分析及文献调研,预测了 Fe2+促进樟芝深层发酵无性产孢的信号通路,即樟芝同时利用还原性铁离子吸收系统和铁载体吸收系统来获取铁离子。对于还原性铁离子吸收系统,即二价铁离子由铁氧化酶(FetC)与铁通透酶(FtrA)形成的高亲和蛋白复合体直接运到胞内;对于铁载体吸收系统,即樟芝先分泌胞外铁载体至外界环境中,螯合环境中的铁离子,然后通过位于细胞膜上的铁载体通道酶(Sit1/MirB)将铁离子运送至胞内,随后铁离子被水解酶(EstB)水解并释放吸收;此外,转录因子HapX和SreA同时响应细胞内Fe2+浓度,分别作用于flbD和abaA基因并促进其表达;同时,铁离子作用于Wsc1压力感受器,并通过级联反应促进了细胞壁完整性(Cell wall integrity,CWI)信号通路中相关基因的表达,最终加快了樟芝无性孢子的细胞壁合成及孢子成熟;TpcA和URBS1直接或间接地促进铁载体合成,最终促进产孢。(3)考察了樟芝菌丝体及牛樟树不同提取物对常见食源性致病菌的抑制作用。首先,通过牛津杯抑菌圈试验发现樟芝菌丝体甲醇提取物及牛樟树不同提取物均对食源性致病菌具有较为显著的抑制效果;随后,通过二倍梯度稀释法发现,樟芝菌丝体各提取物最小抑菌浓度在0.3~41.0 mg/mL之间,牛樟树各提取物最小抑菌浓度在0.78~1.57 mg/mL之间;最后,通过平板菌落计数试验发现,樟芝甲醇提取物对金黄色葡萄球菌和最小弧菌的最大抑菌率可达92%以上,牛樟树甲醇提取物及牛樟树水提物对金黄色葡萄球菌的抑制率均可达90%以上。
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