温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)是变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)的衍生技术,由于它们可对长度一致但碱基序列不同的DNA片段进行有效分离,该技术最初被用于基因点突变研究。1993年首次将其用于微生物生态学研究,分析分子大小相同但序列不同的16S rDNA片段,根据不同细菌其核糖体小亚基基因可变区碱基序列的不同,对其种群多样性、数量比例和系统进化等进行更为详尽的描述。TGGE技术不仅可以分析微生物群落结构组成,还能快速同时对比分析不同的微生物群落之间的差异,也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。同时该技术还具有分辨率高、电泳条件易于控制、重现性好、操作简便快速等优点,因此,该技术出现后很快就被广泛应用于各种微生物生态学研究,目前已发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来,由于传染性非典型肺炎(SARS)和高致病性禽流感在我国部分省市流行,为了预防和控制疫情,在SARS期间和禽流感防治中大量使用了消毒剂。大规模持续使用消毒剂虽然可以提高消毒效果,但同时也加重了环境负担,对生态环境造成不同程度的污染,甚至破坏生态平衡。而生态平衡的破坏往往始于微生物生态的不可逆改变,目前对消毒剂进入环境后对微生物生态的影响所知甚少,因此开展消毒剂进入环境后的微生物生态效应研究十分必要。本研究系科技部SARS专项研究课题(编号:2003A07)的部分内容。目的应用TGGE指纹图谱技术揭示微宇宙细菌种群多样性,初步了解消毒剂对微宇宙细菌群落结构的影响,为合理地使用消毒剂、最大限度地减轻消毒剂对微生态环境的破坏提供科学依据。方法构建6个池塘型微宇宙模拟水生态系统,1个设为对照组,试验组连续投加次氯酸钠13天,投加剂量分别为1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L和20.0 mg/L,停止投加后再观察10天。其中在消毒剂投加前(第0天)、投加后第1天、第5天、第9天、第13天、第15天(停止投加后48 h)、第19天、第23天共8个时期对各微宇宙分别进行采样,并测定游离性余氯和细菌总数,采用涂布平板法37℃培养48 h后提取细菌基因组总DNA,再用通用引物进行16S rDNA V3区扩增,对扩增产物进行TGGE分析,通过对比分析不同剂量组微宇宙8个时期的TGGE指纹图谱,揭示消毒剂对微宇宙细菌群落结构的影响。对微宇宙TGGE图谱中的主要条带进行回收、重新扩增、克隆建库、测序及序列分析,探讨TGGE条带的序列多态性和微宇宙细菌种群多样性。结果投加消毒剂后,游离氯的量与消毒剂投加剂量、投加时间成正比,停止投加后,游离氯量也随之明显下降。消毒剂投加剂量较低(1.0、2.5 mg/L)时,细菌总数不但没有减少,反而明显增加;投加剂量较高(10.0、20.0 mg/L)时,细菌总数明显减少甚至降低为零;停止投加后,细菌总数明显回升。对比分析各试验组微宇宙8个时期的TGGE指纹图谱,结果显示不同剂量组的TGGE指纹图谱存在明显差异,低剂量组图谱在消毒剂投加初期发生主弱条带倒置,但随后即恢复到投加前图谱模式;高剂量组图谱在投加初期变化不明显,但在停止投加后图谱中的主弱条带发生倒置,甚至一条带消失。TGGE条带的序列分析结果表明,同一TGGE条带是由序列不同的片段组成;测序所得21个序列按序列相似性≥97%的标准分成10个操作分类单元(OTU),全部OTU与GeneBank数据库中已登录的细菌种类的同源性均≥97%,根据系统进化关系可将其分为三大类:Bacillus、Pseudomonas和Drinking water bacterium MB16,其中前两者为优势菌群。结论消毒剂进入环境后会对细菌群落结构产生影响,但不同剂量消毒剂产生的影响有显著差异,存在明显的剂量-效应关系:低剂量消毒剂对细菌群落结构的影响比较小,而且是可逆的,微宇宙系统对消毒剂逐渐适应后其群落结构即可恢复;而高剂量消毒剂对细菌群落结构的破坏比较大,且不可逆转,即使消毒剂停止投加后也不能恢复。本研究结果提示,盲目的过量投加消毒剂会对微生态环境造成严重破坏。