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研究目的:用基因工程技术克隆和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的hpaA基因,以期获得重组蛋白HpaA,并鉴定其抗原性和免疫原性,为进一步制备预防H.pylori感染的HpaA制剂提供了材料。采用镍柱层析和切胶纯化两种方法提取可溶性rHpaA,并比较其效果,为hpaA表达中的包涵体纯化提供一条经济便捷的方法。方法:用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段。插入原核表达载体pQE30,转化受体菌DH5α,经克隆及序列分析正确后在大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的分子量和表达形式,经镍柱层析纯化后Western blot证实其抗原性;免疫小鼠后ELISA检测血清特异性抗体鉴定其免疫原性。将SDS-PAGE电泳后的表达蛋白用4M的乙酸钠显色指示切胶,所切胶块在透析袋中经电场作用,提取可溶性目的蛋白,Western blot鉴定其抗原性;同时以间接ELISA法比较分别以切胶纯化法和镍柱层析法所得表达蛋白与抗体结合的滴度。结果:重组表达质粒pQE30-hpaA构建成功,插入的基因片段全长782bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.0%。SDS-PAGE显示表达产物相对分子量为30kD,表达量占全菌总量的32.3%,主要以包涵体形式表达,具有良好的抗原性和免疫原性,镍柱层析纯化后纯度达97%。重组蛋白包涵体经切胶纯化后可得到纯度93.9%的可溶性重组HpaA,Western blot鉴定切胶纯化法提取的可溶性rHpaA也具有良好的抗原性,经ELISA法比较,其抗体结合滴度与镍柱层析法提取的rHpaA相近。结论:H.pylori hpaA基因片段克隆表达成功,获得高纯度可溶性的重组HpaA蛋白,具有良好的抗原性和免疫原性,为进一步制备预防H.pylori感染的HpaA制剂提供了材料。并证实了切胶纯化包涵体蛋白的方法切实可行,与传统方法比较,简单经济实用,为大量制备可溶性HpaA提供了新的方法。