论文部分内容阅读
膜联蛋白(Annexin)是一类具有Ca2+、磷脂以及细胞骨架结合活性的多基因多功能家族。膜联蛋白参与膜的修复与融合，调节生长发育，响应各种环境刺激等多种重要的生理过程。在植物细胞中，膜联蛋白的亚细胞定位与其功能密切相关，并受到细胞内外环境因子的调控。但是，调控膜联蛋白亚细胞定位的分子机理至今还不清楚。本文详细地研究了内质网输出信号调控拟南芥膜联蛋白亚细胞定位的作用机理。 通过对拟南芥膜联蛋白家族8个成员的氨基酸序列进行比对分析，发现该蛋白质序列中存在含DxE双酸基序在内的3种内质网输出信号。为了进一步了解其在膜联蛋白的亚细胞定位中的作用，本研究设计了3种内质网输出信号的不同位置氨基酸的点突变，构建GFP或YFP融合蛋白，通过转基因和激光共聚焦显微镜观察等手段分析了不同的内质网输出信号对于膜联蛋白亚细胞定位的影响，解析了决定膜联蛋白亚细胞定位的分子机理。此外，还分析了DxE双酸基序通过调节膜联蛋白的亚细胞定位对其生理功能的影响。这一研究结果表明:DxE双酸基序对膜联蛋白的亚细胞定位具有关键作用。具体研究结果如下: 1.膜联蛋白氨基酸序列比对结果显示:拟南芥膜联蛋白家族中存在3种内质网输出信号，包括DxE双酸基序、I-L-V(IxxLxxxxxxxxxV)基序和LxxxA基序。其中DxE双酸基序有3个，分别存在于膜联蛋白的N端、中间和C端，I-L-V基序和LxxxA基序各一个。 2.在拟南芥膜联蛋白家族8个成员中，Annexin4(AtANN4)十分特殊，只定位于内质网，与其他成员定位质膜、细胞质等多个亚细胞部位不同。氨基酸序列分析表明，AtANN4的三种内质网输出信号都缺失可能是其滞留于内质网的主要原因。通过点突变恢复AtANN4的三个DxE双酸基序，结果显示只有恢复C端和中间的DxE双酸基序能使AtANN4有效地从内质网中被运出。而恢复N端双酸基序、I-L-V基序或LxxxA基序都不能改变其在内质网的定位。 3.为了进一步了解内质网输出信号在膜联蛋白亚细胞定位中的作用，本研究选择同时具有三种内质网输出信号的AtANN2，通过点突变使其中一个或两个DxE双酸基序缺失，并构建与GFP或YFP的融合蛋白，观察该蛋白质的亚细胞定位变化。结果表明:单独缺失一个DxE基序不会对其亚细胞定位产生影响，而同时突变N端和C端两个DxE基序后，AtANN2会在细胞质中大量聚集。另外，单独突变I-L-V基序不影响该蛋白的亚细胞定位。 4.内质网定位对于ANN4参与盐胁迫反应是必需的。ann4突变体表现为对盐胁迫不敏感，将正常ANN4与C端DxE基序突变的ANN4N306D,R308E转到ann4突变体中，与ANN4/ann4幼苗相比，ANN4N306D,R308E/ann4幼苗表现出对盐胁迫更不敏感的表型。 综上所述，本研究发现了膜联蛋白中存在的内质网输出信号及其在调控蛋白质亚细胞定位中的功能，为进一步利用内质网输出信号调控蛋白质的亚细胞定位提供了新的思路与方法。