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本研究课题以大鼠脑微血管内皮细胞(cerebralmicrovascularendothelialcell，rCMEC)为研究材料，采用细胞生物学方法、分子生物学与生物物理检测方法相结合，包括细胞培养的环境压力和剪应力的调控、三维立体培养方式观察血管生成、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、荧光定量PCR方法检测VEGF的表达、原子力显微镜检测粘性相关量和弹性相关量以及多元统计等方法，主要从以下几个方面探讨了生物力与药物对于血管内皮细胞血管生成的影响。
本实验利用我室自己研制的可单独调节压力和剪应力的平板剪切装置，采用多因素多水平试验的高效设计方法——正交设计(orthogonaldesign)，通过在37℃、5％CO2条件下，对rCMEC施加不同水平的压力、剪应力和川芎嗪16h，经流式细胞术分析，观察了压力、剪应力和川芎嗪联合作用对rCMEC细胞凋亡和细胞周期的影响，多元方差分析结果(表1-1)表明，压力、剪应力和川芎嗪三因素以及它们之间的一级交互作用和二级交互作用均有统计学意义(P＜0.01)，进一步经一元方差分析表明，对细胞周期的各期及凋亡而言，各因素的二级交互作用均有统计学意义(P＜0.01)，故各因素的主效应及其一级交互作用不再考虑，而以三因素的联合作用为主。通过正交设计的方差分析综合来看，凋亡最少的综合条件是压力0mmHg、剪应力10dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml。在该条件下，处于S期细胞也在实验数据的中上水平。
2.压力、剪应力与川芎嗪对rCMEC血管生成的影响本实验采用重复测量设计，利用Matrigel体外培养rCMEC的方法，对经不同压力、剪应力及川芎嗪作用16h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成进行图像分析，结果(表2-1)显示对血管生成而言，两种压力、剪应力和川芎嗪组合(实验1组与实验2组)与对照之间的差异有统计学意义(P＜0.01)，且不同实验条件下不同时间血管生成的差异亦有统计学意义(P＜0.01)。表明当相对压力0mmHg、剪应力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml时，血管生成旺盛，在实验时间段内呈持续增长趋势；而当相对压力40mmHg、剪应力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml时，血管生成缓慢，在实验时间段内先增长后缓慢下降，实验结果提示生物力和药物联合作用对血管生成的影响不容忽视。
本实验利用前述实验装置，采用成组设计，通过在37℃、5％CO2条件下，对rCMEC施加不同水平的压力、剪应力和川芎嗪16h，经相对荧光定量PCR方法测定，以VEGF为目的基因(±argetgene)，β-actin为内对照基因(internalcontrolgene)，同时以对照组为校准(calibrator)，按Livak等的-△△CT方法来进行计算，观察了压力、剪应力和川芎嗪联合作用对rCMECVEGF表达的影响，结果(表3-1)经方差分析表明，当相对压力0mmHg、剪应力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml时，VEGF的表达是对照的4.44倍(P＜0.01)；而当相对压力40mmHg、剪应力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml时，VEGF的表达却仅是对照的0.16倍(P＜0.01)。这说明压力、剪应力和川芎嗪三者不同的组合对VEGF表达的影响不同，可促进或抑制VEGF的表达，从而干预血管生成。
本实验利用前述实验装置，采用成组设计，通过在37℃条件下，对rCMEC施加不同水平的压力、剪应力和替莫唑胺8h，经流式细胞术分析，观察了压力、剪应力和替莫唑胺联合作用对rCMEC细胞凋亡和细胞周期的影响，结果(表4-1)经方差分析表明，对凋亡的影响而言，两种条件即相对压力42mmHg、剪应力20dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L以及相对压力0mmHg、剪应力30dyn/cm2和替莫唑胺300μmol/L与对照比较均有统计学意义(P＜0.01)，而对细胞周期的各期而言，却无统计学意义(P＞0.05)。可能是因为我们在剪切实验时玻片上的细胞生长24h已经铺满，90％以上的细胞处于G0G1期，因而形成了类似细胞同步化的现象；或者是剪切导致的关卡效应，使细胞周期停留在G1-S转变期，G0/G1期细胞比例增加，S和G2/M期细胞比例下降，同时出现了凋亡亚二倍体峰，提示细胞凋亡的发生与剪切延缓细胞周期转换有关，但尚不能判断凋亡细胞具体主要来源于细胞周期的何期，仍需进一步研究。
本实验采用均匀设计，利用Matrigel体外培养rCMEC的方法，对经不同压力、剪应力及替莫唑胺作用8h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成进行测量，3因素8水平共进行8次实验，结果(表5-1)经统计学处理得到多元回归方程如下：y=2332978.20-4346.21X3+403.38X1X2-717.32X2X2+83.86X2X3经方差分析证明方程有意义，验证实验也表明方程的拟合程度亦较好。从方程可知：对于降低血管生成而言，替莫唑胺与剪应力作用为主。对于促进血管生成而言，压力与剪应力有联合作用，剪应力与替莫唑胺的联合作用则较小。促进血管生成的优化组合是相对压力42mmHg、剪应力11.8dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L，血管生成最大为2433012.84μm2；抑制血管生成的优化组合是相对压力0mmHg、剪应力42dyn/cm2和替莫唑胺350μmol/L，血管生成最小为779210.38μm2。
本实验利用前述实验装置，采用成组设计，通过在37℃条件下，对rCMEC施加不同水平的压力、剪应力和替莫唑胺8h，经相对荧光定量PCR方法测定，按Livak等的-△△CT方法来进行计算，观察了压力、剪应力和替莫唑胺联合作用对rCMECVEGF表达的影响，结果(表6-1)经方差分析表明，当相对压力42mmHg、剪应力20dyn/cm2、替莫唑胺0μmol/L时，VEGF的表达是对照的6.01倍(P＜0.01)；而当相对压力0mmHg、剪应力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmol/L时，VEGF的表达却仅是对照的0.11倍(P＜0.01)。说明压力、剪应力和替莫唑胺三者不同的组合对VEGF表达的影响不同，或促进或抑制VEGF的表达。同时我们还观察了压力、剪应力和替莫唑胺联合作用对rCMEC粘弹性的影响，通过使用生物型原子力显微镜对rCMEC成像后，选择细胞膜的不同部位，实施力曲线至饱和，从记录的AmplitudevsDistance曲线上计算粘性相关量和弹性相关量，结果(表6-2)显示两实验组K值均比对照组明显增大(P＜0.01)，且两种处理之间的差别亦显著(P＜0.01)；但实验组和对照组的△S值变化无统计学意义(P＞0.05)。提示经相对压力42mmHg、剪应力20dyn/cm2、替莫唑胺0μmol/L处理8h和经相对压力0mmHg、剪应力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmol/L处理8h后，rCMEC的弹性有不同程度增加，但粘性变化不大。