论文部分内容阅读
目的：1.研究17-demethoxy-reblastatin(17-DR)对人三阴性乳腺癌(Triple-negative breastcancer, TNBC)细胞株MDA-MB-231增殖的影响；2.研究17-DR对MDA-MB-231细胞凋亡的影响；3.探讨17-DR对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的相关分子机制；4.研究17-DR对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响，并探讨其作用机制；5.研究17-DR联合顺铂(cisplatin, DDP)对人TNBC细胞株MDA-MB-231增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法：1. MTT法检测不同浓度（0、12.5、25、50、100、200μmol·L-1）17-DR对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用；克隆形成实验检测不同浓度17-DR对乳腺癌细胞集落克隆形成的影响。2.溴化丙啶（Propidium Iodide, PI）单染结合流式细胞术检测不同浓度17-DR（0、10、50、100μmol·L-1）对乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响。3.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测不同浓度（0、50、100、200μmol·L-1）17-DR对乳腺癌细胞线粒体膜电位的变化。4. Western blot检测乳腺癌细胞MDA-MB-231经不同浓度（0、10、50、100μmol·L-1）17-DR处理后Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP、RIP1以及蛋白的表达情况。5.细胞划痕实验检测17-DR对细胞迁移的影响、Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力。6. Western blot检测乳腺癌细胞MDA-MB-231经不同浓度（0、0.5、5、50μmol·L-1）17-DR处理后基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的表达情况。7.用MTT法、集落克隆形成法检测不同浓度17-DR和/或DDP对细胞增殖抑制的影响。8. PI单染结合流式细胞术检测17-DR和/或DDP作用后细胞的凋亡情况。9. Western blot检测细胞经50μmol·L-117-DR、8μmol·L-1DDP及50μmol·L-117-DR与8μmol·L-1DDP联用作用后Caspase-3、Bax、Bcl-2及RIP1蛋白的表达。结果：1.17-DR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响。1.117-DR能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，且随着17-DR浓度的增加和作用时间的延长增殖抑制作用也不断增强。MDA-MB-231细胞作用72h的IC50为74.9μmol·L-1。50μmol·L-117-DR作用于细胞24h、48h、72h的存活率分别为86.8%、76.2%、49.9%。17-DR也能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231集落克隆的形成。1.2对实验中不同因素处理的细胞按照操作进行PI染色，并通过流式细胞仪分析，观察17-DR诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。50μmol·L-117-DR刺激24h，诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡率为14.1%与阴性对照组0.9%比较有显著性差异（p<0.05）。用100μmol·L-117-DR相同条件处理，诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡率增加到22.6%与对照组比较有显著性差异（p<0.05）。1.3经17-DR处理的MDA-MB-231细胞进行JC-1染色，并通过流式细胞仪分析，结果显示17-DR也产生促进细胞凋亡的作用。2.细胞经17-DR处理后凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3和PARP)以及RIP1、蛋白的表达情况。17-DR能增强Bax蛋白的表达且能诱导caspase底物PARP蛋白的激活并产生了裂解，同时使Bcl-2蛋白表达下调。随着17-DR浓度的增加，RIP1蛋白表达下调，而原型抑制因子I B表达则没有减弱。3.17-DR对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响及其作用机制。17-DR能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移，高浓度17-DR对细胞迁移能力的抑制作用更明显。Transwell细胞迁移实验结果显示17-DR低、中、高浓度（依次为0.5,5,50μmol·L-1），随药物浓度增加对细胞的迁移抑制率也逐渐增加，分别为38.6%、57.7%、68.3%。同时Transwell细胞侵袭实验也显示17-DR随着浓度的增加对细胞侵袭的抑制率也随之增加，分别为38.1%、59.0%、77.1%。17-DR能下调热休克蛋白90(heat shock protein90, Hsp90)顾客蛋白MMP-9的表达，同时使TIMP-1蛋白表达上调。4.17-DR联合DDP对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。不同浓度17-DR或DDP对细胞增殖具有抑制作用，且二者联用时抑制作用增强。50μmol·L-117-DR、8μmol·L-1DDP及二者联用刺激24h诱导细胞的凋亡率依次为14.7%、20.1%、45.2%。联合用药组Caspase-3的激活增强以及下调RIP1蛋白的表达。结论：1.17-DR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有增殖抑制作用，且随着浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低。2.17-DR能够诱导MDA-MB-231细胞的凋亡，其机制可能通过下调Hsp90的顾客蛋白RIP1，增加促凋亡相关蛋白Bax的表达，同时抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，并且激活了促凋亡相关的PARP蛋白。3.17-DR具有抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用，其机制可能通过下调MMP-9，同时增加TIMP-1蛋白的表达来发挥作用。4.17-DR作为Hsp90抑制剂能够增强DDP对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，其机制可能与下调Hsp90的顾客蛋白RIP1的表达相关。5.17-DR作为一种Hsp90抑制剂，对乳腺癌的临床前研究有一定意义。