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实现梨矮化密植是目前中国梨栽培发展中亟待解决的问题，因此选择一种合适的梨矮化砧木成为推动中国梨栽培发展的主要因素之一。与赤霉素合成密切相关的GA20ox基因可以在一定程度上直接或间接控制树体高矮，因而作为本试验的研究重点。
本试验以杜梨为试材，首先采用离体组织培养的方式，优化了杜梨子叶离体再生体系，并找到了省时省力的杜梨子叶外植体消毒方式，进而构建了杜梨子叶的遗传转化体系。同时，对杜梨体内的PbbGA20ox基因进行克隆并测序，并在拟南芥缺失突变体ga5-1中做了杜梨PbbGA20ox基因超表达试验，进行了基因功能验证;构建了3个杜梨PbbGA20ox基因相应的CRISPR/Cas9表达载体，并得到了杜梨抗性植株，旨在为杜梨矮化砧木的选育及杜梨矮化机理研究方面提供试材。其主要研究结果如下:
1.建立了省时省力的杜梨子叶消毒新方法。将之前杜梨子叶消毒常用的0.1％的HgCl2冲洗7min杜梨种子后，再在无菌环境下剥种皮取出子叶的方式，改为直接对杜梨子叶先75％酒精冲洗30s后再使用2％的NaClO冲洗4min，消毒后杜梨子叶的污染率和再生率均较之前无显著差别，而取子叶的过程则不再需要无菌的环境，缩短了剥离杜梨种皮的时间。
2.优化了杜梨子叶离体再生体系。比较了使用6-BA、IBA、TDZ、NAA四种最常用的植物生长调节剂后杜梨子叶再生效果，筛选出了最适合杜梨子叶再生的植物培养基配方:NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.05mg/L+琼脂8g/L或NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L。
3.明确了杜梨子叶与试管幼苗的卡那霉素的最大致死量浓度，构建了杜梨的遗传转化体系。在转化体系中，将杜梨子叶消毒后，依次进行预培养、共培养、筛选培养三步法。其培养基成分与时间依次为:预培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L，暗培养三天;共培养培养基为:NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L，正常光照培养2天;筛选培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L+Kan20mg/L+Cef300mg/L，正常光照培养。
4.构建了杜梨PbbGA20ox基因的植物表达载体PbbGA20ox:35s，并通过农杆菌介导的方式成功导入拟南芥缺失突变体ga5-1中，使其矮化的突变性状被恢复，验证了杜梨PbbGA20ox基因具有可以控制植物株高的功能。
5.构建了3个杜梨PbbGA20ox基因的CRISPR/Cas9表达载体。用Overlapping PCR的方法构建6个的sgRNA表达盒，再将sgRNA表达盒和pCRISPR/Cas9P35S-N质粒经限制性内切酶BasⅠ和T4连接酶的共同作用下，得到3个以卡那霉素筛选标记基因的植物表达载体，并用冻融法将其导入农杆菌GV3101。
6.用携带CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌GV3101去浸染杜梨子叶，得到了5棵具有卡那霉素抗性的杜梨试管苗。
本试验以杜梨为试材，首先采用离体组织培养的方式，优化了杜梨子叶离体再生体系，并找到了省时省力的杜梨子叶外植体消毒方式，进而构建了杜梨子叶的遗传转化体系。同时，对杜梨体内的PbbGA20ox基因进行克隆并测序，并在拟南芥缺失突变体ga5-1中做了杜梨PbbGA20ox基因超表达试验，进行了基因功能验证;构建了3个杜梨PbbGA20ox基因相应的CRISPR/Cas9表达载体，并得到了杜梨抗性植株，旨在为杜梨矮化砧木的选育及杜梨矮化机理研究方面提供试材。其主要研究结果如下:
1.建立了省时省力的杜梨子叶消毒新方法。将之前杜梨子叶消毒常用的0.1％的HgCl2冲洗7min杜梨种子后，再在无菌环境下剥种皮取出子叶的方式，改为直接对杜梨子叶先75％酒精冲洗30s后再使用2％的NaClO冲洗4min，消毒后杜梨子叶的污染率和再生率均较之前无显著差别，而取子叶的过程则不再需要无菌的环境，缩短了剥离杜梨种皮的时间。
2.优化了杜梨子叶离体再生体系。比较了使用6-BA、IBA、TDZ、NAA四种最常用的植物生长调节剂后杜梨子叶再生效果，筛选出了最适合杜梨子叶再生的植物培养基配方:NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+IBA0.05mg/L+琼脂8g/L或NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L。
3.明确了杜梨子叶与试管幼苗的卡那霉素的最大致死量浓度，构建了杜梨的遗传转化体系。在转化体系中，将杜梨子叶消毒后，依次进行预培养、共培养、筛选培养三步法。其培养基成分与时间依次为:预培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L，暗培养三天;共培养培养基为:NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L，正常光照培养2天;筛选培养培养基为NN6922.2g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂8g/L+Kan20mg/L+Cef300mg/L，正常光照培养。
4.构建了杜梨PbbGA20ox基因的植物表达载体PbbGA20ox:35s，并通过农杆菌介导的方式成功导入拟南芥缺失突变体ga5-1中，使其矮化的突变性状被恢复，验证了杜梨PbbGA20ox基因具有可以控制植物株高的功能。
5.构建了3个杜梨PbbGA20ox基因的CRISPR/Cas9表达载体。用Overlapping PCR的方法构建6个的sgRNA表达盒，再将sgRNA表达盒和pCRISPR/Cas9P35S-N质粒经限制性内切酶BasⅠ和T4连接酶的共同作用下，得到3个以卡那霉素筛选标记基因的植物表达载体，并用冻融法将其导入农杆菌GV3101。
6.用携带CRISPR/Cas9表达载体的农杆菌GV3101去浸染杜梨子叶，得到了5棵具有卡那霉素抗性的杜梨试管苗。