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目的三阴型乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指ER、PR和Her2表达均阴性的乳腺癌，由于其侵袭性强、预后差、缺乏有效的靶向药物治疗的特点，而成为近年来研究的热点。PI3K/Akt通路是细胞内重要信号转导通路之一，在包括乳腺癌在内的人类多种肿瘤中活性增高，并且与肿瘤血管形成、侵袭转移、耐药性及放疗抵抗相关。 Skp2作为一种F-box蛋白，是E3连接酶Skp1/Cullin1/F-box (SCF)的组成原件，可特异性识别多种底物并介导其泛素化降解，参与了细胞周期调控、增殖、分化、凋亡与存活等多种过程。在人类多种肿瘤细胞中均发现Skp2过表达，Skp2可作为多种肿瘤的预后因子。近年来研究发现PI3K/Akt通路参与了Skp2信号调节，Skp2SCFE3连接酶亦可反馈调节ErbB受体介导的Akt泛素化，说明PI3K/Akt/Skp2互相之间作用密不可分。在乳腺癌中的相关研究表明，ER(-)乳腺癌较ER(+)乳腺癌中Skp2水平更高，TNBC中pAkt水平和比例较其他亚型显著升高，这些研究提示我们，PI3K/Akt/Skp2通路在TNBC中相较于其他乳腺癌亚型活性更高，这或许与TNBC的生物学特点相关，抑制该通路中的关键事件可能为TNBC的治疗提供新的靶点。该通路在TNBC中的研究，经文献检索，未发现国内外有相关报道。为了明确PI3K/Akt/Skp2通路在TNBC中的作用及可能的作用机制，本研究拟首先在临床病理水平上通过免疫组化明确PI3K/Akt/Skp2通路关键蛋白pAkt和Skp2与乳腺癌分型和病理特征之间的关系，然后，先通过体外实验证实该通路在TNBC的生长、增殖和转移中的作用，最后，通过TNBC裸鼠移植瘤的构建证实抑制该通路关键蛋白Skp2的表达在TNBC体内成瘤过程中的作用。方法1.采用免疫组化SP法，对190例乳腺癌进行分子分型，并检测190例乳腺癌、30例乳腺良性病变中pAkt和Skp2蛋白表达情况。用统计学方法分别比较分析pAkt、Skp2在乳腺癌各分子分型中的表达，pAkt、Skp2表达与ER表达的相关性，pAkt和Skp2在TNBC中表达的相关性，并同时与临床病理因素进行相关性分析。2.采用RNAi技术，构建带有U6启动子、嘌呤霉素筛选标记的Skp2shRNA慢病毒载体LV-shRNA，稳定转染TNBC细胞株，采用Western blotting法检测Skp2表达以明确RNAi的抑制效能。通过MTT实验与细胞克隆形成实验，比较分析Skp2RNA干扰后TNBC细胞增殖能力变化；采用流式细胞技术检测Skp2RNA干扰后TNBC细胞凋亡和细胞周期的变化；采用Transwell实验分析Skp2RNA干扰对TNBC细胞迁移和侵袭能力的影响；采用Western blotting法检测Skp2RNA干扰对pAkt、p27、cyclin D1、caspase9表达的影响，探讨行为学产生的可能的机制。3.构建TNBC裸鼠移植瘤模型，观察皮下成瘤情况，记录每组每只裸鼠的成瘤时间，计算肿瘤体积并称重，根据体积和重量计算肿瘤抑制率，比较RNA干扰Skp2表达对TNBC致瘤能力的影响。结果1.免疫组化染色结果(1) pAkt、Skp2在乳腺癌阳性表达率明显高于乳腺良性病变，差异分别有统计学意义(P=0.029)和显著性意义(P=0.004)。(2) pAkt和Skp2表达与乳腺癌的组织分级、TNM分期和淋巴结转移相关(P=0.004,P=0.001,P=0.033; P=0.001,P=0.022, P=0.002)，而与患者的年龄、肿瘤大小无关(P=0.807,P=0.227; P=0.523,P=0.513)。(3)在Luminal A型、Luminal B、Her2阳性型和三阴型乳腺癌中，pAkt阳性表达率分别为18.8%、13.8%、42.8%、58.9%；Skp2阳性表达率分别为20.8%、20.7%、42.8%、53.8%。pAkt和Skp2在三阴型中的阳性表达率分别均显著高于各自在LuminalA型和Luminal B型的阳性表达率(P=0.000,P=0.000; P=0.000,P=0.006)，但是与Her2阳性型相比无统计学差异(P=0.233,P=0.417)。(4) pAkt和Skp2的表达与ER表达显著负相关(r=-0.365，P<0.01；r=-0.296，P<0.01)。(5)在三阴型乳腺癌中，pAkt和Skp2的表达显著正相关(r=0.692，P<0.01)。2.成功构建了两个靶向干扰Skp2基因表达的RNAi慢病毒表达载体LV-Skp2-A和LV-Skp2-B，并筛选出TNBC稳定转染细胞株。3.RNA干扰Skp2表达可上调TNBC细胞中p27、caspase9的表达，下调pAkt、cyclinD1表达。4.RNA干扰Skp2表达可使TNBC细胞停滞于G0/G1期，而使进入S期细胞减少，并使细胞凋亡率显著升高。5.RNA干扰Skp2表达后，TNBC细胞的增殖能力受到抑制，且随着时间延长抑制作用越明显；TNBC细胞的克隆形成能力受到抑制。6.RNA干扰Skp2表达后，TNBC细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制。7.成功构建TNBC裸鼠移植瘤模型，靶向干扰Skp2表达后，TNBC细胞的体内致瘤活性受到抑制。结论1.乳腺癌组织中pAkt、Skp2表达阳性率明显高于乳腺良性病变，pAkt、Skp2表达与乳腺癌的组织分级、TNM分期和淋巴结转移相关，表明pAkt和Skp2参与乳腺癌的发生发展过程。2.在ER(-)乳腺癌中pAkt、Skp2表达阳性率显著高于ER(+)组，pAkt和Skp2的表达与ER表达显著负相关。在三阴型乳腺癌中，pAkt和Skp2的表达显著正相关，表明两者在ER(-)乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌中可能有着重要作用。3.利用慢病毒介导的RNA干扰技术，可下调Skp2表达，并引起TNBC细胞中p27、caspase9表达的上调，pAkt、cyclinD1表达的下调。4.RNA干扰Skp2表达后，TNBC细胞的体外增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移和侵袭能力均受到抑制，证实Skp2在TNBC增殖和转移中有重要作用。5.体内试验中，靶向干扰Skp2表达可抑制TNBC细胞的致瘤活性，提示抑制Skp2表达可能是TNBC治疗的新靶点。