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宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈上升趋势。目前常规治疗宫颈癌的手术,化疗,放疗等方法对提高患者生存率以及改善预后效果均不佳,因此,探索宫颈癌的基因治疗方案已成为研究的热点。稳定表达转染普通人类细胞的端粒酶能够无限地分裂,从而证明了端粒的缩短可以控制复制衰老。Kim研究发现MKRN1能够介导hTERT泛素化降解,由此提示MKRN1参与肿瘤老化死亡,与肿瘤关系非常密切。目前国内外关于MKRN1的研究进展十分缓慢,有关MKRN1的生物学功能与信号转导通路等尚不十分清楚。因此,本研究小组首先构建了人MKRN1基因的重组siRNA腺病毒载体,转染宫颈癌hela细胞,为今后MKRN1基因在宫颈癌细胞中的功能研究提供了有利的工具,也为在动物整体水平方面的研究奠定了良好的实验基础;其次构建了真核表达MKRN1基因的载体,并在宫颈癌siha细胞中稳定表达,从而在细胞水平探讨MKRN1基因功能及其对细胞增殖和凋亡的影响。本课题研究内容包括三个部分:1.构建人MKRN1基因重组siRNA腺病毒载体并在宫颈癌hela细胞中表达。方法:将合成的MKRN1基因的siRNA干扰序列克隆到pSES-HUS穿梭载体上,从而得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA重组载体。再将其在BJ5183感受态细菌中同源重组腺病毒骨架质粒pAdeasy-1,从而得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA重组载体;同时设立对照组。腺病毒包装HEK293细胞,并感染MKRN1阳性表达的宫颈癌细胞hela细胞,用RT-PCR方法及Western blotting技术检测重组腺病毒对hela细胞中MKRN1表达的变化,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果:重组MKRN1siRNA腺病毒载体构建成功;重组MKRN1siRNA腺病毒感染组与对照组相比,宫颈癌hela细胞中MKRN1的表达受到显著抑制,细胞中端粒酶的活性显著上调。结论:重组MKRN1siRNA腺病毒载体能有效地抑制hela细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的工具。2.真核表达载体pEGFP-N1- MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达。方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入真核表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;G418筛选稳定Siha细胞株;RT-PCR,Western blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的表达。结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1477bp的片段,经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,倒置荧光显微镜下可观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Siha细胞中稳定表达。结论:真核表达载体pEGFP-N1- MKRN1成功构建,并筛选获得了人MKRN1基因的稳定表达Siha细胞株,为进一步研究人MKRN1基因对宫颈癌Siha细胞增殖及凋亡的影响提供了实验基础和重要的细胞模型。3.稳定表达MKRN1基因对人宫颈癌Siha细胞的影响方法:利用本实验小组构建的稳定表达MKRN1基因的Siha细胞株,观察MKRN1基因对hTERT基因mRNA转录表达水平,端粒酶活性以及其对细胞周期的影响。结果:转染Siha细胞后,稳定表达MKRN1明显抑制细胞hTERT基因mRNA水平的表达,显著抑制细胞中端粒酶的活性,并且G1期细胞显著增加,而S期细胞明显减少。结论:稳定表达MKRN1可特异性地降低宫颈癌细胞中hTERT的mRNA水平,抑制癌细胞内端粒酶活性,抑制宫颈癌细胞增殖,并且阻止宫颈癌细胞从G1期进入S期,促进细胞凋亡,从而为探索宫颈癌基因治疗的新方法提供了依据。