基于aptamer-光子晶体微球液相芯片技术检测农产品中多种真菌毒素的研究

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:bigtree16
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真菌毒素是粮食等农产品中常见的污染物,而且农产品中常常同时存在多种真菌毒素,这对人类健康已造成严重威胁。目前,国内外关于真菌毒素的检测方法较多,但它们往往存在工作量大、成本高,试剂损耗多等不足。本论文选取了具有代表性的真菌毒素(赭曲霉毒素A和伏马毒素B1)作为检测对象,利用三维光子晶体微球作为液相芯片载体,基于核酸适配体识别技术和荧光分析技术建立一种高通量、高灵敏度、低成本并可同时检测多种真菌毒素的新方法。具体开展的工作如下:(一)利用实验室自制微流控装置,制备出尺寸均一、大小可控的二氧化硅光子晶体微球,利用光纤光谱仪测量不同种微球的反射峰位置,实现微球编码。试验对微球表面的功能化进行了研究,以增强其与生物分子的结合能力,并且使功能化后微球的荧光背景达到最低,减小误差,使有利于下一步的检测研究。(二)以光子晶体微球为液相芯片载体,基于核酸适配体技术和荧光分析技术建立了农产品中的赭曲霉毒素A(OTA)的检测方法。通过对试验反应条件的优化,最终确定OTA-aptamer序列浓度为400nmol/L,其荧光标记互补序列浓度为500nmol/L,杂交条件为37℃下反应2h,OTA结合反应条件为37℃下反应1h。利用最佳反应条件,制作出OTA的单重检测标准曲线,线性范围为1-0.001ng/mL,线性方程为y=992.61+224.35x,R2=0.994。特异性试验结果显示,方法特异性强,与黄曲霉毒素B1(AFB1)、伏马毒素B1(FB1)并无明显交叉反应。最后在三种不同农产品中添加不同浓度的OTA进行回收率测定,其回收率分别为:大米73.73±2.39%~106.90±5.37%、玉米90.67±5.27%~125.17±2.31%、小麦87.91±5.26%~119.55±7.82%。(三)在研究(二)的基础上,建立了农产品中的两种毒素(OTA、FB1)的同时检测方法。通过将微球表面包被不同的毒素-核酸适配体序列,并使其与相应荧光标记互补序列杂交,形成微球-适配体-互补链复合物,然后将其同时置于混合样品中进行两种毒素的检测。最终确定OTA、FB1这两种毒素的检测线性范围分别为:1-0.01ng/mL、1-0.001ng/mL;线性方程分别为:y=1054.35+322.89x(R2=0.986)、y=1491.68+410.88x(R2=0.994)。然后在谷物中添加不同浓度的OTA、FB1进行回收率测定,回收率范围分别为:81.8±6.28%~116.38±7.60%、76.58±5.96%~122.32±2.89%。最后使用本实验方法对21份谷物样品进行了检测,同时用ELISA方法进行对照,两种方法结果经统计学分析显示无显著性差异(P>0.05)。
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