研究背景在我国的城镇居民中,脑血管疾病已成为患者死亡的首要原因,其中颅内出血(intracerebral homorrhage,ICH)约占脑卒中患者的15%,发病一个月内死亡率约为50%,而且发病年龄越来越年轻化。在ICH患者中,有5-10%的患者出血部位在小脑,最终致死率高达20-30%。通过尸检发现,小脑出血患者的死亡主要是出血和水肿形成脑疝,造成对脑干的压迫和破坏所引起的。所以及早判定患者病情变化和及时采取临床干预措施是治疗疾病、挽救生命的关键。目前,脑CT是诊断小脑出血最可靠的检查方法,但它较少用于连续动态检查,如果反复检查,费用较高,且需要运送患者,在不方便的同时也可能引起患者病情的恶化。现在,在临床上缺乏对小脑出血患者的病情发展进行床旁动态监测及对病情是否波及脑干进行预判的方法和手段。本实验研究一种临床监测手段,它具有床旁、动态、无创、简单、客观、准确的优点。最重要的是,它既能够在小脑出血和水肿侵犯脑干时进行判断,又能够监测小脑出血和水肿对脑干由刺激到破坏的动态过程,为临床医生及时判断患者病情变化和及早进行临床干预提供了可能。目的1建立稳定的小脑半球出血大鼠模型,观察和总结不同程度出血大鼠在术后72h的自发眼震和冰水诱发眼震电图( ENG ,electronystagmogram)的变化特点和规律,观察模型大鼠枕大池压力(pressure of cisterna magna,PCM)和脊髓蛛网膜下腔压力(pressure of spinal subarachnoid space,PSSS)及压力差,探讨利用ENG监测小脑出血病情变化和预先判断小脑脑疝发生的可行性。2观察小脑半球出血模型大鼠脑干眼动相关神经核团(脑桥旁正中网状结构(paramedian pontine reticular formation,PPRF)、前庭神经核(vestibular nucleus,VN)和动眼神经核(oculor motor nucleus,OMN))的神经递质受体GABA-ARα1和NMDAR1变化及相关神经核团的HE染色变化,探讨小脑半球出血继发脑干病变引起自发眼震和冰水诱发眼震异常的神经化学机制。3观察电刺激及电凝损毁大鼠小脑绒球小结叶(flocculonodular lobe,FL)和顶核(fastigial nucleus,FN)后自发和冰水诱发ENG变化及VN神经递质受体GABA-ARα1和NMDAR1变化,通过与小脑出血引起眼震异常的比较及对VN神经递质受体变化的分析,探讨小脑半球出血引起自发眼震和冰水诱发眼震异常的病理生理基础。方法第一部分:小脑半球出血大鼠模型的建立及对眼球震颤的分析1根据Rosenberg报道的方法,立体定位小脑齿状核,注射Ⅶ型胶原酶建立小脑半球出血大鼠模型。动物随机分为5组:假手术组、0.2UⅦ型胶原酶组、0.4UⅦ型胶原酶组、0.6UⅦ型胶原酶组、0.8UⅦ型胶原酶组,每组8只。在小脑半球出血大鼠模型建立72h时,采集以下指标2使用RM6240C多道生理记录仪记录其自发和冰水诱发ENG。3分别测量其枕大池和脊髓蛛网膜下腔压力,并计算二者间的压力差。4使用4℃多聚甲醛灌注固定大鼠,取出脑组织,以针道所在中心,穿刺平面前后,切片机作冠状切片,常规HE染色,根据公式计算血肿面积。5处死大鼠,剥离颅骨取出脑组织,分离脑干和小脑,使用干湿重法测定小脑半球出血后脑组织含水量。第二部分:小脑半球出血模型大鼠自发和冰水诱发眼震的神经化学机制研究1通过免疫组化法观察模型大鼠PPRF、VN和OMN抑制性神经递质受体GABA-ARα1和兴奋性神经递质受体NMDAR1变化情况。2通过HE染色镜下观察模型大鼠小脑及脑干组织病理学改变。第三部分:大鼠一侧小脑绒球小结叶和顶核电刺激及电凝损毁后眼震电图变化电刺激及电凝损毁大鼠一侧小脑绒球小结叶和顶核,观察其自发眼震和冰水诱发ENG改变及脑干VN神经递质变化。结果第一部分:1动物存活率:40只实验大鼠共死亡8只,其中1只因麻醉过量死亡,另外7只死于脑疝,动物存活率为87.5%。2 PCM、PSSS和两者间的压力差:在术后72h时,0.2U组、0.4U组、0.6U组和0.8U组大鼠PCM、PSSS与假手术组大鼠相比有明显差异(P<0.05),胶原酶注入剂量越大,大鼠PCM、PSSS越高,二者间压力差越大(P<0.05)。3大鼠模型建立72h自发眼震:在假手术组大鼠未观察到自发震颤,ENG记录可见正弦平滑曲线为扫视眼球运动,未见眼震样锯齿波。所有胶原酶诱导小脑出血模型组大鼠72h均出现自发性眼震。0.2U组大鼠可观察到旋转性眼震,在ENG上为水平方向上快相向左、慢相向右,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震;0.4U组大鼠也表现为旋转性眼震,其方向与0.2U组大鼠相反;0.6U组大鼠出现了快相向左,慢相向右的水平性自发性眼震,伴有间断性发作的快相向上、慢相向下或者快相向下、慢相向上的垂直性眼震;0.8U组大鼠死亡前眼球固定,未记录到自发眼震,ENG呈一条直线。4大鼠模型建立72h冰水诱发眼震:假手术组大鼠一侧冰水诱发后可见快相向冰水对侧,慢相向冰水侧的水平跳动性眼震。0.2U组大鼠右侧冰水诱发为快相向左、慢相向右的水平为主伴有垂直方向的眼震,其潜伏期(Lat,latency)与假手术组比较无差异(P>0.05),频率(F,Frequency)(P<0.05)、波幅(Amp,amplitude)、慢相角速度(SPV,slow-phase velocity)及变异系数(CVI,circadian variation index)均高于假手术组(P<0.01)。左侧冰水诱发眼震在水平方向上与右侧冰水诱发方向相反,Lat较假手术组延长(P<0.01),F、Amp、SPV均低于假手术组(P<0.05),CVI增大(P<0.01)。0.4U组大鼠右侧冰水诱发眼震在水平方向上与0.2U组相同,Lat较假手术组延长(P<0.01),Amp(P<0.05)、F、SPV均低于假手术组(P<0.01),CVI增大(P<0.01);左侧冰水诱发眼震在水平方向上与0.2U组相同,Lat与假手术组比较无差异(P>0.05),F、Amp、SPV及CVI均高于假手术组(P<0.01)。0.6U组大鼠右侧冰水诱发眼震在水平方向上为快相向左,慢相向右的眼震,Lat与假手术组比较无差异(P>0.05),F、Amp(P<0.05)、SPV及CVI均高于假手术组(P<0.01);左侧冰水刺激未诱发出眼震。0.8U组大鼠双侧冰水刺激均未诱发眼震。5大鼠小脑血肿面积:各造模组大鼠在72h可见注入胶原酶一侧小脑半球肿胀、饱满;部分大鼠脑组织出现移位,中线向对侧偏移,脑干受压扭曲变形。假手术组大鼠注射侧脑组织仅见注射针道,未见血肿及水肿。各造模组可见小脑半球出血,出血中心呈暗红色,出血部位相近,分布均一,周围灰白质分界模糊。不同剂量胶原酶组形成的血肿面积大小不同,其组间对比有统计学差异(P<0.05),注入胶原酶剂量越多,血肿面积越大。6脑组织含水量:胶原酶注射各组大鼠脑组织含水量测定明显高于假手术组(P<0.05)。胶原酶注射各组大鼠脑组织含水量与胶原酶剂量呈正相关(P<0.05),即胶原酶注入剂量越大,脑组织含水量越多,脑水肿越明显。第二部分:1脑干眼动相关神经核团递质变化:细胞膜被DAB染成棕黄的阳性细胞在脑干内呈群集样分布,抑制神经递质比( GABA-ARα1/GABA-ARα1+ NMDAR1 )和兴奋神经递质比(NMDAR1/ GABA-ARα1+ NMDAR1)在假手术组脑干两侧PPRF、VN和OMN内无差别(P>0.05);0.2U组大鼠脑干右侧PPRF兴奋神经递质比高于左侧(P<0.05),左侧OMN和VN兴奋神经递质高于右侧(P<0.05);0.4U组大鼠脑干左侧PPRF兴奋神经递质比高于右侧(P<0.05),右侧OMN和VN兴奋神经递质高于左侧(P<0.05);0.6U组大鼠脑干右侧PPRF兴奋神经递质比高于左侧(P<0.05),左侧OMN和VN兴奋神经递质高于右侧(P<0.05);0.8U组大鼠脑干PPRF、VN和OMN神经递质较假手术组及其他造模组表达下降,但右侧PPRF和兴奋神经递质比相对高于左侧(P<0.05),左侧OMN和VN兴奋神经递质相对高于右侧(P<0.05)。2模型大鼠小脑及脑干组织病理学:光镜下观察HE染色可见造模侧血肿区域内大量红细胞及炎性细胞聚集,血肿中心及周围神经细胞肿胀,体积增大,周围出现空隙;神经纤维排列紊乱、中断、疏松;部分小血管闭塞。胶原酶注入剂量越大,红细胞及炎性细胞聚集越明显,组织疏松水肿范围越大。0.2U及0.4U组大鼠脑干HE染色与假手术组对照无异常,在0.6U组因脑疝死亡的大鼠及0.8U组大鼠的脑干中,可见脑干中纵行和横行的神经纤维组织紊乱、中断及疏松,以脑桥延髓阶段中线结构改变明显;炎性细胞聚集,胞核增大深染,嗜酸性增强,其间散在分布的神经细胞核群内部分细胞出现细胞肿胀,细胞核碎裂或脱失,此改变以脑桥及延髓阶段右侧明显。第三部分:大鼠右侧绒球小结叶和顶核电刺激及电凝损毁后自发和冰水诱发眼震特点及ENG1右侧小脑绒球小结叶电刺激后自发和冰水诱发眼震特点及ENG:为旋转性眼震,在ENG上为水平方向上快相向左、慢相向右,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震。右侧冰水诱发眼震在形式上表现为水平方向上快相向左、慢相向右,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震。ENG表现与正常对照组相比,Lat无差异(P>0.05),F加快、Amp增加,SPV增快和CVI增大(P<0.01);左侧冰水诱发眼震在形式上表现为水平方向上快相向右、慢相向左,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震,ENG表现与正常对照组相比,Lat延长(P<0.01)、F减慢、Amp和SPV减小(P<0.01),CVI增大(P<0.01)。2右侧绒球小结叶电凝损毁后自发和冰水诱发眼震特点及ENG:为旋转性眼震,在ENG上为水平方向上快相向右、慢相向左,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震。右侧冰水诱发眼震在形式上表现为水平方向上快相向左、慢相向右,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震,ENG表现与正常对照组相比,Lat延长、F减慢、Amp和SPV减小(P<0.01),CVI增大(P<0.01);左侧冰水诱发眼震在形式上表现为水平方向上快相向右、慢相向左,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震,ENG表现与正常对照组相比,Lat无差异(P>0.05),F增加、Amp、SPV增大(P<0.01)和CVI增大(P<0.01)。3右侧顶核电刺激后自发和冰水诱发眼震特点及ENG:大鼠右侧顶核电刺激后出现了快相向右,慢相向左的水平性自发性眼震,伴有间断性发作的快相向上、慢相向下或者快相向下、慢相向上的垂直性眼震。右侧冰水诱发眼震在水平方向上与正常对照组比较无差异,Lat延长,F、Amp、SPV均低于对照组(P<0.01),CVI高于对照组(P<0.01)。左侧冰水诱发表现为快相向右,慢相向左的水平眼震,Lat与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05),F、Amp、SPV及CVI均高于正常对照组(P<0.01)。4右侧顶核电凝损毁后可观察到旋转性眼震,在ENG上为水平方向上快相向左、慢相向右,垂直方向上为快相向上、慢相向下的眼震。右侧冰水诱发眼震在水平方向上表现为快相向左、慢相向右的眼震,Lat与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05),F、Amp、SPV及CVI均高于正常对照组(P<0.01)。左侧冰水刺激诱发眼震在形式上方向与右侧冰水相反,但Lat延长,F、Amp、SPV均低于对照组(P<0.01),CVI增大(P<0.01)。5右侧绒球小节叶电剌激,脑干右侧VN兴奋神经递质比低于左侧(P<0.05),右侧绒球小节叶电凝损毁后,脑干右侧VN兴奋神经递质比高于左侧(P<0.05)。6右侧顶核电剌激,脑干右侧VN兴奋神经递质比高于左侧(P<0.05),右侧顶核电凝损毁后,脑干右侧VN兴奋神经递质比低于左侧(P<0.05)。结论1应用不同剂量胶原酶立体定向注入大鼠小脑齿状核可以成功构建不同出血量的小脑出血动物模型。2大鼠小脑的出血量不同,自发眼震和冰水诱发眼震的表现形式也不同。3大鼠小脑不同的出血量对脑干形成不同的影响,而根据眼震尤其是冰水诱发眼震的不同变化形式可以判定小脑出血后脑干的功能状态。4 PCM、PSSS升高及两者压力差的存在可能是小脑出血后眼震发生变化的原因。