原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP),既往称为特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP),是临床上最常见的免疫性出血性疾病,以外周血中血小板数目减少为特点,患者体内血小板板数减少会增加出血的风险,轻者可无出血症状,严重者可出现月经过多、皮肤粘膜出血,甚至内脏或颅内出血(1-5%患者)危及生命。ITP的发病机制复杂,主要为血小板自身抗体介导的血小板破坏增多。患者自身免疫失耐受,产生了针对血小板表面糖蛋白(glycoprotein,GP)主要为针对GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX的自身抗体,此外也有少部分针对GPIa/Ⅱa、GPIV、GPV及GPVI的抗体,以上自身抗体与血小板表面糖蛋白抗原表位结合后,抗体的Fc段与网状内皮系统中组织性巨噬细胞的FcγRⅡa及FcγRⅢa结合,介导抗体包被的血小板在脾脏网状内皮系统中被单核巨噬细胞识别、吞噬并破坏,使患者外周血小板生存期缩短,数量减少,导致出血症状。其次细胞毒性T细胞介导的血小板破坏和巨核细胞的凋亡异常及成熟障碍导致的血小板生成不足也在部分ITP患者发病中起重要作用。吞噬作用是先天性和获得性免疫中的重要组成部分,在抵抗致病菌入侵的第一道防线中起到重要作用,并在维持和调节体内稳态中也发挥作用。吞噬作用失调不仅仅会导致宿主细胞对致病菌的免疫异常,而且会导致免疫耐受失调从而产生慢性炎症和自身免疫性疾病。吞噬过程可被多种细胞表面受体诱发,其中主要有以下两类:其一为非调理素受体,此类受体可以直接识别并与目标分子结合;其二为调理素受体,调理素受体可以识别调理素分子如抗体、补体。在调理素受体中,Fcγ受体是研究的热点,它可以与IgG的Fc部分结合,也可通过结合补体C3bi部分与补体受体3(CR3)相识别。目前推荐的ITP一线治疗方法包括免疫抑制和免疫调节剂(例如:肾上腺皮质激素治疗、静脉丙种球蛋白治疗(IVIg)和抗-Rh(D)免疫球蛋白治疗)。以上三种制剂都可以竞争性结合单核巨噬细胞上的Fc受体,阻碍了单核巨噬细胞与抗体包被的血小板的结合,防止血小板滞留于脾内网状内皮系统,减少单核巨噬细胞对血小板的吞噬,并抑制单核巨噬细胞的趋化作用和迟发超敏反应,改善毛细血管通透性,缓解出血症状。但是上治疗可能会导致严重的副作用,如糖皮质激素可导致皮质功能亢进综合征、骨质疏松等副作用。静脉丙种球蛋白治疗虽具有IgG含量高、稳定性好等优点,患者注射后可使体内的IgG水平迅速升高,用药24h后即可观察到血小板计数上升,约1周左右达峰值。但患者的治疗反应是暂时的,血小板计数难以长期维持,在治疗3-4周后血小板计数即降至治疗前水平,极少数病例可表现为持续反应,导致患者需定期接种、治疗费用昂贵。对于以上治疗效果欠佳的患者,二线治疗措施首选脾切除。本病易反复发作、病程长,部分患者对现有一线、二线治疗无效或在短期内复发,反复治疗迁延不愈发展为难治性ITP,显著降低了患者的生存质量。CD44分子是一种分布广泛的细胞表面黏附分子,可表达在白细胞、角质形成细胞、软骨细胞、上皮细胞和一些内皮细胞和神经细胞。CD44分子可识别透明质酸(HA)和骨桥蛋白,是细胞与细胞、细胞与ECM相互识别和作用的分子基础。之前的研究已经证实,CD44分子的激活可以调节炎症反应。例如,带有透明质酸片段的CD44分子可以诱导多种炎性细胞因子的产生,体外试验也证明CD44分子同时还可以直接调节中性粒细胞的迁移,此外CD44分子与透明质酸分子的相互作用还可以调节淋巴细胞的粘附。CD44分子抗体已成功应用于多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的动物模型,包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、胶原或抗体诱导的关节炎、自身免疫性糖尿病、实验性自身免疫性葡萄膜炎、实验性溃疡性结肠炎、实验性肺嗜酸性粒细胞增多症和皮肤迟发型超敏反应等,但其具体作用机制仍不十分清楚。IM7是一种鼠抗人CD44单克隆抗体,可识别CD44分子胞外部分,已广泛应用于许多研究,其强大的抗炎作用已经在多种疾病模型中被证实。此外,CD44单克隆抗体KM81,KM201和KM114也被证明在关节炎中具有部分抗炎作用。我们之前的研究还发现CD44单克隆抗体KM114可以明显改善ITP小鼠模型中SCID小鼠的血小板减少症状,对照组SCID小鼠接受腹腔注射血小板抗体处理后血小板数量明显下降,实验组接受CD44分子抗体KM114和静脉注射丙种球蛋白(IVIg)预处理的SCID小鼠体内血小板的破坏程度显著下降,这表明CD44抗体可以在被动ITP小鼠模型中与静脉注射丙种球蛋白(IVIg)起到相似的治疗作用,且这种作用不依赖于与B或T细胞的相互作用。以上研究结果为ITP的治疗提供了新的方向。此外,丙种球蛋白来自于血浆产品,制作成本高、产量有限,临床使用费用昂贵,然而CD44单克隆抗体相比而言,可以节省成本,也可为患者减少治疗费用,有重要的研究价值及前景。在本项研究中,我们利用流式细胞仪及共聚焦显微镜等方法检测CD44单克隆抗体预处理对巨噬细胞吞噬能力的影响,证据表明,抗CD44单抗IM7、KM114都可以抑制巨噬细胞FcyR介导的血小板吞噬作用,且相同浓度的IM7相较于KM114而言,对巨噬细胞吞噬作用有更强的抑制作用。此外,数据表明CD44分子抗体不影响血小板与巨噬细胞的结合,我们推测CD44单抗作用于结合后的巨噬细胞内吞过程。然而对于巨噬细胞Fc γ R介导的红细胞吞噬作用仅IM7可以起到抑制作用。目的:CD44单克隆抗体的广泛抗炎特性,以及之前研究结果表明KM114等CD44单克隆抗体可以在ITP小鼠模型中起到治疗作用促使我们想要探究它是否能抑制巨噬细胞的吞噬功能。利用抗体包被/未包被的红细胞/血小板与巨噬细胞共培养,检测巨噬细胞的吞噬作用,在体外模拟ITP的主要发病机制;将经过CD44抗体预处理的巨噬细胞与抗体包被的红细胞/血小板共培养,检测不同表型及不同浓度的CD44单克隆抗体对巨噬细胞吞噬作用的影响,并分析其与抗体表型及浓度的关系;检测不同表型及不同浓度的CD44单克隆抗体与巨噬细胞表面CD44分子的结合能力,明确CD44单克隆抗体作用产生的具体机制。方法:1.培养RAW264.7小鼠巨噬细胞、THP-1人白血病单核细胞系。2.用PMA刺激THP-1细胞过夜,使之进一步分化为巨噬细胞。3.收取CD1野生型雌性小鼠的腹腔巨噬细胞,培养得原代小鼠腹腔巨噬细胞。4.收取CD1野生型雌性小鼠的外周血,Coulter counter计数血小板数目、Grava流式细胞仪计数红细胞数目,离心获取红细胞及血小板。5.用Ter-119及Mwreg30等抗体包被红细胞/血小板,将抗体包被的红细胞/血小板与小鼠巨噬细胞在37℃共培养30分钟。6.倒置显微镜检测巨噬细胞内吞的红细胞数目,在显微镜下随机计数200-300个巨噬细胞,计算巨噬细胞吞噬指数(PI),即PI=被内吞的所有红细胞数/巨噬细胞总数×100。7.流式细胞术检测巨噬细胞内血小板的含量,即以CMFDA标记血小板,以CMFDA的平均荧光强度来反应巨噬细胞对抗体包被的血小板的吞噬指数。8.巨噬细胞吞噬试验检测CD44分子抗体对巨噬细胞吞噬能力的影响。即以CD44单克隆抗体KM114/IM7预处理巨噬细胞,并将抗体包被的红细胞/血小板与小鼠巨噬细胞共培养30分钟。9.荧光共聚焦显微镜检测小鼠腹腔巨噬细胞对抗体包被的山羊红细胞的吞噬指数,即预先以CMFDA标记红细胞,待与巨噬细胞共培养后,以Alexa Fluor-643标记的兔抗羊二抗标记巨噬细胞外的红细胞,以Alexa Fluor-555标记的麦芽胚凝集素染色巨噬细胞膜,在显微镜下分别计数200-300个巨噬细胞内的红细胞,计算巨噬细胞吞噬指数(PI=巨噬细胞内吞的红细胞数/巨噬细胞总数× 100)。10.荧光共聚焦显微镜检测巨噬细胞对血小板的吞噬指数及结合指数,即预先以CMFDA标记血小板,待与巨噬细胞共培养后,以Alexa Fluor-647标记的羊抗鼠二抗标记巨噬细胞外的血小板,在显微镜下分别计数200-300个巨噬细胞内/外的血小板,计算巨噬细胞吞噬指数(PI=巨噬细胞内吞的血小板数/巨噬细胞总数×100)。同时计算血小板与巨噬细胞的结合指数(BI=结合在巨噬细胞表面的血小板数/巨噬细胞总数× 100)。11.CD44分子抗体结合实验,检测CD44分子抗体与巨噬细胞的结合能力。即以CD44单克隆抗体KM114/IM7预处理巨噬细胞,以PE标记的羊抗鼠二抗标记巨噬细胞表面结合的CD44分子抗体,利用流式细胞术检测,以PE的平均荧光强度来反映CD44分子抗体与巨噬细胞的结合能力。结果:1.抗体包被后的红细胞/血小板可以被巨噬细胞识别并吞噬。用抗体TER-119包被的小鼠外周血红细胞的吞噬指数(RAW264.7细胞PI=157.2;THP-1细胞 PI=89.63),明显高于未处理组 P<0.0001(RAW264.7 细胞 PI=0;THP-1细胞PI=0.49),并且流式细胞仪检测得与Mwreg30抗体包被的血小板共培养的巨噬细胞的平均荧光强度明显高于未处理组(1849 vs 458,P<0.001)。2.检测IM7/KM114预处理后巨噬细胞对TER-119包被的小鼠红细胞的吞噬作用。结果表明,在RAW264.7及THP-1分化的巨噬细胞中,对照组(PI=157.2、89.63),IM70.1ug/ml时吞噬指数(PI)分别为 157.2、30.49;1 μg/ml、10μg/m丨时PI为0,与对照组有明显差异(P<0.0002),并且这种抑制作用表现为剂量依赖性。然而KM114预处理对两种巨噬细胞对小鼠红细胞的吞噬功能没有影响(KM114 10μg/ml 时 PI=139.47、64.2,P>0.55)。3.CD44分子抗体可以抑制巨噬细胞对血小板的吞噬作用,当IM7浓度为0.1μg/ml时,对巨噬细胞的吞噬作用表现为部分抑制作用(P<0.001);当IM7浓度为1 μg/ml时即可达到几乎完全抑制作用(P<0.0001)。当KM114浓度为0.1 μg/ml时,可起到轻微抑制作用(P<0.001);当KM114浓度为1 μg/ml、10μg/ml时,表现为对吞噬作用部分抑制作用(P<0.0001)。相同浓度的IM7的抑制作用强于 KM114(P<0.02)。KM114 10μg/ml 时与 IM7 1μg/ml 表现为相同程度的抑制能力(P=0.71)。4.CD44分子抗体不影响巨噬细胞与血小板的结合。两种同型对照及低浓度CD44单抗处理后,血小板结合指数与对照组相比均无明显差异(P>0.5)。仅在IM7高浓度时(1μg/ml、10μg/ml)表现为巨噬细胞表面结合的血小板增多。5.CD44分子抗体IM7与巨噬细胞的结合率大于KM114。RAW264.7巨噬细胞中,IM7在浓度为5 u g/ml即可达到90%结合率;同浓度的IM7与KM114相比,IM7与巨噬细胞的结合率明显高于KM114(P<0.001)。其中KM114 10μg/ml与IM7 1 μg/ml表现为相似的与巨噬细胞的结合率(P>0.5)。KM114在浓度为0.1 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml时与同型对照无显著性差异(P>0.5),在浓度为5 μ g/ml时,结合率为95.4%明显高于未处理组(P<0.008)。THP-1细胞中,IM7可以与THP-1细胞表面的CD44分子结合,当IM7浓度为0.1μ g/ml时与对照组无显著性差异(P=0.36),在浓度为10 μ g/ml即可达到90%结合率(P<0.0002)。然而在所有KM114处理组中均与未处理组无明显差异(P>0.5),表明KM114分子无法与THP-1细胞表面的CD44分子结合。结论:1.抗体包被后的红细胞/血小板可以被巨噬细胞识别并吞噬,可以在体外模拟ITP的发病机制。2.IM7预处理可以抑制抗体介导的巨噬细胞对红细胞的吞噬作用,并且这种抑制作用表现为剂量依赖性。然而KM114预处理对巨噬细胞对小鼠红细胞的吞噬功能没有影响。3.IM7和KM114对抗体介导的巨噬细胞对血小板的吞噬作用均有抑制作用,并呈现出剂量依赖性,且相同浓度的KM114与IM7相比抑制作用稍弱。说明CD44单克隆抗体可以作为治疗ITP的新手段。4.CD44分子抗体不影响血小板与巨噬细胞的结合,推测CD44单抗作用于结合后的巨噬细胞内吞过程。5.CD44分子抗体IM7与巨噬细胞的结合率大于KM114,可能是导致IM7对吞噬作用抑制作用较强的原因。