苯丙胺脱氢酶的创制及其在手性胺合成中的应用

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手性胺是合成许多药物、天然产物、精细化学品及生物活性分子的关键中间体,同时它也是一种高效的手性拆分剂。目前,工业上主要利用酸碱和过渡金属催化烯酰胺和烯胺等中间体不对称还原的方法制备手性胺。化学法制备手性胺存在能耗大、反应步骤多和最终得率较低等诸多不足,因此研究开发更加绿色高效的手性胺合成工艺显得尤为重要。胺脱氢酶可利用无机氨作为氨基供体,催化酮不对称胺化还原制备手性胺。该反应具有反应条件温和、原子经济性高、水是唯一的副产物等优点,因此胺脱氢酶是手性胺不对称合成的理想催化剂,在国际学术界和工业界引起广泛关注。目前,已报道的大部分胺脱氢酶是由L-氨基酸脱氢酶进化而来,其数量有限且底物谱窄;此外,酶的热稳定性也是影响其实际应用的关键因素。因此,本研究的主要目的是通过基因组数据库挖掘和分子改造手段,创制热稳定性好、催化效率高的苯丙胺脱氢酶,拓展其底物谱,促使其在手性胺合成中得到广泛应用。本文首先通过数据库挖掘法克隆得到4个苯丙氨酸脱氢酶,经过蛋白可溶性表达情况分析、活力及热稳定性表征,最终我们筛选得到一个来自于嗜热菌Geobacillus kaustophilus的苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH。GkPheDH的热稳定性好(T5015为78℃),对天然底物苯丙酮酸的催化效率高,因此将其作为后续研究的对象。其次,我们对GkPheDH中与底物苯丙酮酸羧基结合的两个氨基酸残基Lys78和Asn276进行定点突变,获得具有催化酮不对称胺化还原功能的双突变体K78S/N276L(GkAmDH)。酶学性质研究表明,GkAmDH的最适pH和最适温度分别为9.0和55℃,其热稳定性好,蛋白解链温度高达71℃;GkAmDH在NH3·H2O/NH4COOH缓冲液中的操作稳定性好,可高效催化酮不对称胺化还原合成手性胺,其对映体选择性高达99%;此外,我们发现GkAmDH可利用有机伯胺作为氨基供体不对称合成手性仲胺。最后,我们尝试通过分子改造,提高GkAmDH的催化效率,通过几轮定点饱和突变和随机突变库的筛选,最终获得一个催化效率(kcat/KM)提高2.3倍的双突变体T129L/K282N。此外,为进一步拓展苯丙胺脱氢酶的底物谱,我们对GkPheDH中与天然底物苯丙酮酸羧基相结合的两个氨基酸残基进行定点饱和突变和组合突变,筛选得到一系列可高效催化邻位羟基酮不对称胺化还原的苯丙胺脱氢酶变种,从而实现了手性氨基醇的高效绿色生物合成。
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