粒细胞集落刺激因子是动员骨髓移植造血干细胞和祖细胞的重要药物。它还可用于治疗因化疗和骨髓移植等疾病引起的中性粒细胞减少症。人G-CSF的重组形式以其通用名称Filgrastim而为人所知。另外,G-CSF水平升高也与一些疾病有关,如在骨髓增生性疾病或细菌感染的患者中,血清G-CSF水平明显升高。然而,G-CSF水平升高对骨骼健康有不利的影响。先前的研究表明,长期给予G-CSF治疗可显著降低骨矿物质密度并诱发椎体的压缩性骨折。小鼠G-CSF的过度表达可导致小梁骨和皮质骨厚度减少。因此,有必要了解G-CSF影响骨细胞特性的机制。有趣的是,相关研究显示成骨细胞系或原代成骨细胞不表达G-CSF的受体(G-CSFR)。这表明G-CSF的骨质减少作用是由非成骨细胞类型介导的。另外,G-CSF受体在许多其他细胞类型上表达,包括造血细胞,内皮细胞,神经元和肌肉细胞。骨髓移植试验研究明确表明,G-CSF对成骨细胞的抑制作用是通过造血细胞介导的。在造血细胞中,在淋巴细胞缺陷小鼠中可观察到类似的作用,因而G-CSF对成骨细胞的抑制作用不是由淋巴细胞引起的。已有研究证实G-CSF抑制成骨细胞的作用是由中性粒细胞介导的,因为中性粒细胞的消耗会部分消除G-CSF对成骨细胞的抑制作用。G-CSF对成骨细胞抑制作用是通过抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡或成熟成骨细胞转化为静止的骨细胞。G-CSF治疗还可增强小鼠和人类破骨细胞的形成和活性。另外,来自造血谱系髓样细胞的破骨细胞也表达G-CSF,因此破骨细胞是G-CSF作用的直接靶标。在体外条件下,破骨细胞的形成和活性随着G-CSF的增加而增加。尽管G-CSF对成骨细胞和破骨细胞的作用效果取得很大进展,但G-CSF如何影响骨细胞仍不清楚。本实验证实G-CSF长期治疗可降低小鼠骨组织中成骨细胞数量和新形成的骨细胞。成骨细胞分化的基因标记显著减少,骨细胞活性的基因标记亦减少。我们的研究还发现,成骨细胞数量减少是由于成骨细胞凋亡增加引起,而这是由中性粒细胞分泌的一氧化氮增加所介导的。骨折发生后的骨折不愈合或延期愈合是骨科中常见的并发症,这不但给病人的肉体上和精神上带来巨大痛苦,也给社会带来沉重的经济负担。骨折发生时或后期治疗过程中出现的血管损伤导致的血液供应不足是引起骨折不愈合或延期愈合的常见原因。目前越来越多的研究证实血管在骨折愈合过程中起至关重要的作用,骨折部位的血管损伤和血流障碍是一个引起骨不连或骨折延期愈合的重要原因。在动物骨折模型的研究中通常是通过剔除骨折部位附近的软组织(包括局部血管)或制造肢体的局部缺血来达到骨不愈合或延迟性骨愈合的效果。同样在临床上,骨不连或延迟性骨愈合骨痂组织中也能观察到由于缺少血管导致的血供缺乏区。因而,发现新的药物,通过其刺激血管生长改善血液供应来防止骨折后不愈合或延期愈合是骨科学和相关研究领域的重要命题。临床上骨质疏松性骨折,因骨量的丢失以及骨组织微环境的改变,骨折愈合往往会出现延迟。尤其是绝经后妇女的骨质疏松性骨折,因雌激素水平的下降、骨组织骨量的明显减少,对骨折愈合也会产生明显的影响。目前已有大量关于卵巢切除后骨质疏松的基础研究报道,并且对于骨质疏松性骨折的研究多集中在形态学和生物化学的改变,但对骨质疏松后骨折部位血运供应情况的研究并不多见。本实验模拟绝经后骨质疏松性骨折,建立了小鼠卵巢切除后的骨折模型,证实卵巢切除小鼠骨折早期愈合出现延迟,同时发现早期骨组织新生血管量出现明显减少。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是迄今发现的最重要的组织细胞氧浓度依赖的感应调节因子,在骨修复过程中HIF处于被激活的状态。HIF是一个异源二聚体,包括α、β二个亚基。正常生理状态下,HIF-1α蛋白分子中脯氨酸残基被脯氨酰羟化酶(PHDs)羟基化,羟基化HIF-1α可迅速被细胞浆内的蛋白酶降解。PHDs的活性既依赖于细胞内氧浓度,也需Fe2+、2-oxyglutarate等参与。在低氧条件下或Fe2+、2-oxyglutarate匮乏时,PHDs活性受到阻抑甚至失去活性,从而导致HIF-1α在细胞浆内累积。积聚的HIF-1αα亚基转移至细胞核内,在细胞核内HIF-1α与HIF-1β结合形成二聚体,进而激活HIF的下游直接靶基因,目前发现近百个受HIF-1调控的基因,涉及细胞生物学行为的多个方面,这些基因产物(如红细胞生成素—EPO、糖代谢转运因子—Glut、和血管内皮生长因子—VEGF等)的表达,在血管重塑、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖、凋亡等方面发挥重要作用。认为,包括加强呼吸等全身性或细胞性的多种低氧反应,均处于HIFs调节之下;HIFs是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境稳定的核心因子。在意识到血供在骨折愈合中起到的重要作用后,许多研究都集中到想通过干预血管重塑来改善血液供应。当前越来越多的研究对使用血管内皮生长因子促进血管生成发生了浓厚的兴趣。最近研究证实了在兔子临界缺损骨折中局部运用VEGF提高了骨折的愈合。但是,因价格问题和需要蛋白重组甚至基因疗法的参与,给在临床上直接应用VEGF带来困难。抑制PHDs的小分子药物可以用来阻断HIF-1α亚基的降解,进而激活了 HIF的通路。普遍意义上这些小分子应该具有干扰PHDs所需要的铁螯合剂或2-oxyglutarate的类似物的能力。DF0(去铁胺)是一种Fe2+络合剂,临床上常用于金属离子中毒的治疗。在HIF-1α代谢过程中,DFO可通过与细胞内Fe2+的络合作用而抑制PHDs和FIH的活性,从而造成细胞内HIF-1α累积。前期实验研究在考查了多种可抑制PHDs活性进而调节HIF-1α形成的化合物的基础上,发现:在体外常氧培养环境内,当应用含DFO(I0μM或50μM或200μM)条件培养液进行干预时,可明显促进骨髓基质干细胞(MSCs)形成HIF-1α及表达VEGF mRNA;刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成血管样小管状结构;提高胚胎跖骨内皮“枝芽“的形成数量。在体内,当将DFO(200μM)直接注射至实验性骨折模型局部时,X-线和μCT图像显示,DFO可显著提升骨痂组织内血管与新骨的形成,骨修复加速。本实验在卵巢切除小鼠骨折模型中,局部应用DFO,促进了新生血管的长入以及骨痂的生成,最终促进骨折的愈合。第一部分G-CSF通过上调中性粒细胞一氧化氮的产生抑制小鼠成骨细胞和骨细胞生长的研究目的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)水平增高对骨骼健康有不良影响,先前有研究广泛证实了 G-CSF对成骨细胞和破骨细胞的影响,但其具体的作用机制以及如何影响骨细胞仍不太清楚,本文旨在进一步研究G-CSF对成骨细胞和骨细胞的影响及作用机制。方法1.8-10周龄雌性C57BL/6小鼠,分为对照组、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组、G-CSF+Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)组,每组各10只小鼠。各组小鼠分别皮下注射溶剂、G-CSF和G-CSF+L-NAME。治疗后10天后处死动物。2.收集各组小鼠的外周血液在肝素化血液采集管中以进行全血细胞计数检测。3.收集各组小鼠的股骨进行组织切片以及免疫组化检测4.冲洗出各组小鼠股骨骨髓,并且在通过Trizol方法获得RNA,进行实时定量PCR检测。结果1.G-CSF治疗显著降低成骨细胞和新生骨细胞的数量。2.G-CSF引起的成骨细胞谱系细胞数量减少是由于细胞凋亡增加所导致的。3.G-CSF诱导的成骨细胞凋亡,是由嗜中性粒细胞的一氧化氮分泌增加所引发。结论G-CSF对于成骨细胞和骨细胞的抑制作用是由于促进中性粒细胞分泌一氧化氮所引发。第二部分小鼠骨质疏松性骨折模型早期骨折愈合延迟的初步实验研究目的探讨骨质疏松小鼠骨折愈合延迟的机理。方法60只C57BL/6小鼠随机分为OVX组(N=30)、SHAM组(N=30)。小鼠双侧卵巢切除后4周建立右侧股骨骨折模型。骨折术后第2周行X线、Micro-CT、组织学切片、免疫组化和血管灌注检测。结果Micro-CT以及组织学证实OVX组小鼠骨折愈合延迟;免疫组化表明OVX组新生骨痂组织中VEGF的表达降低;血管灌注表明2周OVX组新生血管量较CON组明显减少。结论0VX组小鼠骨痂组织中VEGF表达的减少可能是导致骨痂中新生血管减少的重要原因,进而由于新生血管的减少可能导致OVX组小鼠骨折早期愈合延迟。第三部分局部应用去铁胺激活低氧诱导因子通路促进卵巢切除小鼠骨折愈合目的在卵巢切除小鼠骨折模型中,局部注射去铁胺(DFO),评估是否能够促进卵巢切除小鼠的骨折愈合。方法首先,将40只7周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为卵巢切除(OVX)组(n=20)和假手术(SHAM)组(n=20)。卵巢切除后4周取材,收集小鼠的子宫称重,一侧股骨行micro-CT分析。然后将90只7周龄雌性C57BL/6小鼠分为三组:OVX+Saline,OVX+DFO,和 SHAM+Saline 组(n=30)。小鼠双侧卵巢切除后 4 周建立右侧股骨骨折模型。手术后第二天用500μl胰岛素专用注射针筒在股骨骨折处注射药物DF0200μM或生理盐水20μ1,每隔一天注射一次,一共5次。在骨折愈合过程的第2、4和8周取材,分别进行X线、Micro-CT、组织学、免疫组织化学、血管灌注检测和生物力学分析。结果实验第一部分证实,卵巢切除4周后,小鼠子宫明显萎缩,骨量出现明显丢失,骨质疏松模型建模成功。在第二部分中,由于卵巢切除小鼠雌激素水平下降以及骨量的丢失,骨折愈合过程出现明显变化。骨折术后2周,OVX+Saline组小鼠骨痂体积以及新生血管的数量较SHAM+Saline出现明显下降,骨痂组织中HIF-1α 和VEGF的表达也出现明显下降;骨折后4周,OVX+Saline组小鼠骨痂的总体积以及骨体积较SHAM+Saline都有明显减少;骨折后8周,OVX+Saline组小鼠的生物力学性能较SHAM+Saline组也出现明显下降。骨折端局部注射DFO以后,骨折愈合出现明显改善。骨折后两周,OVX+DFO组小鼠骨痂体积和新生血管数量较OVX+Saline组有明显上升,骨痂组织中HIF-1α 和VEGF的表达也有一定的提高;骨折后4周,OVX+DFO组小鼠骨痂总体积以及骨体积较OVX+Saline组也有明显增加;骨折后8周OVX+DFO组小鼠的生物力学性能较OVX+Saline组也出现明显上升。结论局部应用DFO可以促进卵巢切除小鼠的骨折愈合。