研究背景：头颈部恶性肿瘤约占全身恶性肿瘤的5.6%,其中80%是鳞癌。而口腔鳞癌是头颈部恶性肿瘤中比较常见的恶性肿瘤之一。近几年来,随着对于肿瘤发病机制和治疗的研究进展,口腔鳞癌的生存率有了显著提高,5年生存率约60%。口腔鳞癌的发病是一个多因素多步骤的过程,包括众多的致病因素,如放射线、不良牙体刺激等物理因素,酒精、烟草等化学刺激,微量元素的缺乏等营养因素,等等。最近几年,随着肿瘤免疫学的研究进展,对于口腔肿瘤致病的免疫学研究受到了越来越多的重视。机体免疫调节机制的改变,肿瘤特异性抗原改变都有可能导致机体对于肿瘤细胞免疫监视的缺失,造成肿瘤细胞的免疫逃逸,导致肿瘤的发生。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是一种与IL一7类似的细胞因子,由Friend1994年从胸腺基质细胞的培养上清中分离获得。TSLP在免疫学领域研究较多,TSLP的主要作用是可以促进T细胞增殖以及B淋巴细胞的生长、分化,而且与树突状细胞的成熟、活化和迁移的调控密切相关,并在胸腺的调节性T细胞分化中发挥重要作用。TSLP可以在多种组织细胞中表达,包括部分肠道上皮、受刺激后的胃粘膜、食管黏膜上皮、心脏、肝脏、前列腺细胞等等。最近的几年研究发现,TSLP可以在多种肿瘤细胞中表达,包括乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌,等等。肿瘤中的TSLP可以促进Th2型细胞的增殖、分化或募集,并与多种肿瘤细胞的增殖和血管生成密切相关。关于TSLP在口腔鳞癌中的表达的研究罕见报道。本文拟采用多种实验方法研究口腔鳞癌组织中的TSLP的表达,并且探讨TSLP在口腔鳞癌细胞中的表达和肿瘤细胞的增殖、肿瘤微环境中免疫状态的改变的关系,以期为口腔鳞癌的发生发展机制研究提供参考。第一部分口腔鳞癌中TSLP的表达及临床意义口腔鳞癌是头颈部恶性肿瘤的的一种常见的肿瘤。胸腺基质淋巴细胞生成素是一种与IL一7类似的细胞因子,可以在多种组织细胞和免疫细胞表面有表达。最近的研究发现TSLP可以在多种肿瘤细胞中有表达,可以通过多种机制促进肿瘤的发生和进展。但是TSLP在口腔鳞癌中的表达还未见报道。鉴于此,本部分实验首先研究TSLP在口腔鳞癌中的表达情况,并探讨其与临床病理参数的关系。目的与方法选取30例具有完整临床病理资料的口腔鳞癌患者的组织学标本和外周血为研究对象,并选取10例正常的口腔黏膜作为对照,采用免疫组化的方法和RT-PCR方法,分别从蛋白水平和mRNA水平比较TSLP、TSLP-R在口腔鳞癌和正常组织中的表达的差异,并用ELISA方法比较口腔鳞癌患者和正常对照外周血中TSLP浓度的变化,结合患者的临床病理资料,分析TSLP在口腔鳞癌中的表达及与临床病理参数之间的关系。结果通过免疫组化的染色,我们发现TSLP和TSLP-R在口腔鳞癌组织及癌旁组织中都呈高表达,而在正常组织的上皮细胞中仅仅是弱表达或者无表达,鳞癌组织中TSLP的mRNA的量是正常组织中的1.9185倍,口腔鳞癌组织和正常对照组织中的TSLP-mRNA的相对表达量分别为0.016516士0.003522和0.008609士0.00045;口腔鳞癌患者外周血中TSLP的平均浓度是26.16士13.37,而正常对照的外周血浓度是3.35士3.31,患者组的TSLP的浓度显著高于对照组(P<0.001)。口腔鳞癌患者肿瘤细胞中的TSLP的表达与患者的临床分期、病理分级、年龄、性别都无显著相关性。口腔鳞癌细胞本身及周围浸润淋巴细胞同时存在着TSLP-R的高表达,染色集中在胞浆中和胞膜上。TSLP-R在口腔鳞癌和癌旁组织中的表达并无显著差异,但是都显著高于正常的对照组织。结论口腔鳞癌组织及癌旁组织中存在着较高的TSLP和TSLP-R的表达,口腔鳞癌患者的组织和外周血中TSLP和TSLP-R的表达都显著高于正常对照,口腔鳞癌组织中TSLP和患者的临床病理参数之间并无显著相关性。但是肿瘤细胞分泌的TSLP可以直接作用于自身及周围浸润的大量淋巴细胞。第二部分口腔鳞癌中TSLP和FOXP3的表达及关系研究肿瘤微环境中的免疫调节的改变是促进肿瘤发生发展的重要因素。前期的实验中发现了口腔鳞癌组织中存在着TSLP和TSLP-R的高表达。TSLP-R不但可以表达在肿瘤细胞自身,还可以表达在肿瘤周围浸润的淋巴细胞的表面。TSLP无论在外周还是在胸腺中,都可以诱导Treg细胞的分化成熟,肿瘤的微环境中存在的CD4+CD25+Treg细胞本身即是一种重要的免疫调节细胞,它可以抑制机体对于肿瘤细胞的特异性的免疫反应,导致肿瘤的免疫逃逸。FOXP3是CD4+CD25+Treg的功能状态的特异性的抗原。本实验就是通过研究口腔鳞癌组织微环境中存在的FOXP3+的Treg细胞,结合TSLP和TSLP-R的表达,探讨TSLP在口腔鳞癌中的表达与FOXP3+淋巴细胞之间可能存在的关系。目的及方法选取30例具有完整临床病理资料的口腔鳞癌患者的组织学标本作为研究对象,首先运用免疫组化的单染,研究FOXP3在口腔鳞癌组织中的表达,结合TSLP-R在组织中的表达状况,运用免疫组化双染TSLP-R和FOXP3,研究口腔鳞癌中表达的TSLP和FOXP3+的淋巴细胞之间的关系,从而探讨TSLP在口腔鳞癌组织微环境中免疫学调节改变的作用。结果1.口腔鳞癌组织中可见较多的FOXP3阳性淋巴细胞的存在。肿瘤组和癌旁组FOXP3+阳性淋巴细胞比例分别为(23.32±4.30)%VS(18.24±4.80)%,而正常的对照组中FOXP3+淋巴细胞则罕见。口腔鳞癌组织和癌旁组织中FOXP3阳性淋巴细胞比例都显著高于口腔正常对照黏膜组织。癌旁组织中,同样可见大量的FOXP3阳性的淋巴细胞存在。2.口腔鳞癌细胞巢周围浸润的淋巴细胞中可见较多的TSLP-R阳性的淋巴细胞,呈团或散在存在3.在口腔鳞癌组织的浸润的淋巴细胞中,存在着一定数量的的TSLP和FOXP3双染的淋巴细胞。在转移的淋巴结中,我们也发现了部分的双染细胞的存在,而在正常淋巴结中则并没有发现双染细胞的存在。结论口腔鳞癌组织中不但存在着大量的FOXP3阳性的淋巴细胞浸润,而且在这些FOXP3+细胞的表面还存在着一定数量的TSLP-R,口腔鳞癌细胞中分泌的TSLP,通过作用于表面具有TSLP-R的淋巴细胞,促进FOXP3+Treg细胞的分化,成熟或聚集,同时淋巴结内存在的TSLP,通过作用于TSLP-R表达阳性的淋巴细胞,也可诱导FOXP3+的Treg淋巴细胞的分化及募集,而后者保护转移的口腔鳞癌细胞免于淋巴细胞的杀灭作用,促进口腔鳞癌的淋巴转移。第三部分TSLP与口腔鳞癌细胞增殖的关系研究肿瘤细胞的失控增殖是肿瘤发生的重要因素。在第一部分实验中我们发现了口腔鳞癌细胞不但可以分泌大量的TSLP,存在着TSLP的高表达,并且发现了TSLP-R在自身胞浆和胞膜中的表达。口腔鳞癌分泌的TSLP可以通过与其表面表达的TSLP-R结合,以自分泌的方式作用于肿瘤细胞自身。TSLP在最初发现时即发现具有促进细胞增殖的作用,组织细胞中分泌的TSLP可以直接或间接的促进多种组织或免疫细胞的增殖。口腔鳞癌中分泌的TSLP通过与自身的受体结合对于口腔鳞癌细胞的增殖又是否有关呢?因此本部分实验的主要目的就是探讨口腔鳞癌肿瘤细胞中分泌的TSLP与自身增殖的关系。目的与方法选取口腔鳞癌Tca8113细胞系作为研究对象,培养稀薄,待细胞恢复活力后,分别在细胞的培养基中加入TSLP、TSLP中和抗体,并且设立阴性对照,在不同时间点,运用MTT法研究细胞的增殖状况并加以比较,分析三组间细胞增殖的变化,探讨TSLP对于Tca8113细胞增殖的作用。结果1.分别加入TSLP、TSLP中和抗体及PBS24小时后,三组细胞均出现了不同程度的增殖现象,其中TSLP组的增殖稍高于对照组和TSLP中和抗体组,但是差别无统计学意义。而对照组和TSLP中和抗体组的增殖无明显差异。2.加药48小时,TSLP组和对照组的肿瘤细胞均出现了较为明显的增殖,但是TSLP组的增殖更为明显,而TSLP中和抗体组的增殖缓慢,三组相比较,发现TSLP组的增殖显著高于对照组及中和抗体组,而对照组和中和抗体组的增殖差别并不明显。3.加药后72小时,对照组和TSLP组均出现了更为明显的增殖,三组相比较,TSLP组显著高于中和抗体组和对照组,而对照组的增殖也显著高于中和抗体组,差别具有统计学意义。结论口腔鳞癌细胞分泌的TLSP可以直接作用于自身肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的增殖,TSLP对于细胞的增殖促进作用,在口腔鳞癌发生的早期即已发生,从而促进口腔鳞癌的发生和进展。