春雷霉素是由春雷链霉菌(Streptomyces kasugaensis)产生的一种重要的氨基糖苷类抗生素,能与细菌核糖体30S小亚基结合,通过有效抑制蛋白合成的肽链延长来发挥杀菌功能,因而作为高效广谱低毒的生物农药被广泛应用于农业病害防治。春雷霉素生物合成基因簇于2006年被报道,但迄今为止其生物合成和调控机制的研究十分有限。本研究在春雷霉素生物合成基因簇的左翼序列鉴定了五个与春雷霉素生物合成调控相关的基因:途径特异性正转录调控因子kasT,双组份调控系统kasW/kasX,MerR家族负转录调控因子kasV和推测编码异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶的基因kasS。KasT蛋白与链霉素生物合成的途径特异性转录因子StrR高度同源,前期研究显示KasT可以结合春雷霉素生物合成基因的启动子区。我们首次建立了春雷链霉菌BCRC12349(Streptomyces kasugaensis BCRC12349,LY)的遗传操作系统,成功敲除了kasT。kasT缺失后春雷霉素不再产生,春雷霉素合成基因的表达量剧烈下降,kasT回补后春雷霉素恢复产生,而kasT加倍后可以将低产菌株LY中的春雷霉素产量提高3倍。这是第一次通过体内实验证明了kasT是春雷霉素生物合成的途径特异性正调控因子。KasW和KasX分别与双组份调控系统LuxR家族的应答蛋白和组氨酸激酶具有很高的同源性。我们通过基因敲除和转录分析鉴定了kasW和kasX的功能。kasW、kasX缺失突变株中春雷霉素的产量分别提高了12%和19%,qRT-PCR结果显示,突变株中春雷霉素生物合成基因表达量均显著提高,说明kasW/X是春雷霉素生物合成的负调控基因;KasV蛋白与MerR家族转录调控因子同源性较高,kasV突变使春雷霉素产量提高194%,生物合成相关基因的表达量提高4-8倍,表明kasV是春雷霉素生物合成的关键负调控基因;kasS与kasV位于同一个转录单元,KasS与异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶具有较高的同源性。通过基因敲除和转录分析,我们发现kasS缺失使春雷霉素的产量提高22%,春雷霉素生物合成相关基因的转录水平提高3-9倍,说明kasS与春雷霉素生物合成调控间接负相关。因此,我们证明在低产菌株LY中敲除负调控基因kasW/kasX/kasV/kasS或加倍表达正调控基因kasT,可以有效地提高春雷霉素的产量。基于在低产菌株中成功的产量提高策略,我们尝试对高产的春雷霉素产生菌小金色链霉菌XM301(Streptomyces microaureus XM301,HY)进行基因工程改造。高产菌株HY的春雷霉素产量是低产菌株LY的10倍以上。初步的基因组序列比对发现二者基因组具有高度相似性,而且春雷霉素生物合成基因簇序列完全相同。在高产菌株HY中敲除kasW/kasX,春雷霉素产量提高了58%,但是高表达kasT并未导致春雷霉素产量的明显变化;kasV的缺失突变株中春雷霉素生物合成基因的表达量提高了4-8倍,但是产量并没有明显变化;kasS突变株的春雷霉素产量下降了43%,春雷霉素生物合成相关基因的转录水平明显降低,这与低产菌株中kasS的调控功能相反。为了寻找低产菌株和高产菌株调控功能差异的原因,我们进行了高产菌株HY和低产菌株LY的全基因组测序和转录组测定。转录组分析显示,高产菌株HY中的春雷霉素生物合成基因表达量是低产菌株LY的40-80倍,暗示高产菌株中春雷霉素生物合成基因的转录已经处于一个较高的水平,继续提高其转录具有一定局限性,应该考虑其他的春雷霉素生物合成相关因子并加以改造。综上所述,本研究在春雷霉素产生菌中首次对春雷霉素合成的调控机理进行研究,鉴定了五个与调控相关的基因,并且通过低产菌株中调控基因的功能鉴定,指导了高产菌株的高产改造。我们不仅成功地获得了春雷霉素的高产衍生菌株,同时比较了低产菌株和高产菌株的差异,为抗生素高产菌株的改造提供了借鉴。