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脑缺血再灌注损伤发生和发展的病理生理学方面的机制相对较为复杂。有研究认为自噬和凋亡在其中起到了重要的作用，尤其在脑缺血发生后，缺血的中心区出现了大量的坏死神经元细胞，但周边缺血半暗带区很少有细胞的坏死发生，发现这些区域的细胞坏死与凋亡存在着一定的关系，而且挽救半暗带区受伤神经元细胞的一个重要方法是尽早的恢复缺血组织的血供。在脑缺血再灌注时，脑组织神经元细胞中CGRP的含量相对增高，其能够起到扩张脑血管的作用，使缺血的脑组织尽量有血液供应。CGRP的产生对神经元细胞起到了重要的保护作用，能够减少脑缺血再灌注中神经元细胞凋亡的发生，从而缩小脑缺血再灌注中脑梗死面积，能改善脑组织中神经元细胞的功能，减少脑缺血再灌注后带来的后遗症，提高脑卒中患者的生活质量，但CGRP在脑组织中的具体作用机制仍然不是很清楚。当脑缺血发生时，脑组织中的神经元细胞处于缺血、缺氧的条件时，神经元细胞会发生自噬和凋亡。但是自噬是一把“双刃剑”，当轻度的自噬发生时，自噬对细胞起到了积极的作用，能够维护细胞的正常功能，当重度的自噬发生时，会影响细胞的存活，导致细胞死亡。但是在脑缺血再灌注中，凋亡起到了相对重要的作用，凋亡介导了中心缺血区大量神经元细胞的死亡。在脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的发生也涉及到了分子生物学的机制，脑缺血时会影响内环境的稳定，诱导蛋白酶的活化：有丝分裂原激活蛋白（MAPKs）信号转导通路和钙调节蛋白依赖性激酶（CaMKs）的活化。其中有丝分裂原激活蛋白（MAPKs）信号转导通路在细胞凋亡与存活中起到了重要的作用。MAPKs信号通路得到了较为广泛的研究，在脑缺血再灌注中的作用也越来越受到重视。现研究认为MAPK信号转导通路主要的信号通路是：细胞外调节蛋白激酶（extra cellular regulated protein kinases,ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）通路、P38MAPKs通路。MAPKs家族的三条重要的信号通路在脑缺血再灌注的具体作用机制仍不是很清楚，以及CGRP对脑组织的保护作用与这三条信号通路之间有何关系，也是不清楚。本实验以脑缺血再灌注大鼠为研究对象，通过检测脑组织中蛋白的表达水平及TTC染色显示的梗死面积，探讨脑组织中CGRP对脑缺血再灌注大鼠的神经元细胞的作用，以及是如何发挥作用？与JNK信号通路，P38MAPK信号通路和ERK信号通路之间的关系？方法1．健康成年的雄性Wistar大鼠，体重250-300g。根据改良的大鼠脑中动脉线栓法，通过栓塞脑中动脉制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的动物模型。随机分为Sham组、MCAO组、MCAO+CGRP组、MCAO+CGRP+CGRP8-37组、MCAO+CGRP+ERK抑制剂PD98059组、MCAO+CGRP+P38抑制剂SB203580组。每组24只动物。造模成功后，给予CGRP（3μg/kg）静脉给药，同时静脉注射CGRP抑制剂CGRP8-37（2.5mg/kg），腹腔注射ERK抑制剂PD98059（1mg/kg），腹腔注射P38抑制剂SB203580(5mg/kg,溶于5mg/m l DMSO)进行药物治疗。2．观察大鼠脑局灶性缺血神经行为评分，以及CGRP对大鼠脑局灶性缺血神经行为评分的影响。通过TTC染色观察大鼠脑缺血再灌注之后梗死范围以及测量梗死面积。3．Western blot检测大鼠脑组织中JNK，p-JNK，ERK，p-ERK，P38，p-P38的蛋白表达。4．免疫组化方法检测大鼠脑组织中p-JNK，p-ERK，和p-P38的分布及表达情况。结果与讨论：1．大鼠脑局灶性缺血大鼠神经行为评分的结果显示：与MCAO组相比，MCAO+CGRP组，大鼠神经行为评分明显降低（P<0.01）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP8-37组、MCAO+ERK抑制剂组PD98059组、MCAO+P38抑制剂SB203580组的神经行为学评分明显升高(P<0.01)。2．脑组织TTC染色结果显示：与MCAO组相比，MCAO+CGRP组的脑组织的梗死面积明显减少（P<0.001）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP8-37组、MCAO+ERK抑制剂PD98059组、MCAO+P38抑制剂SB203580组的脑组织梗死面积明显增加（P<0.01）。3．脑组织Western blot的结果显示：与MCAO组相比，MCAO+CGRP组的p-JNK的蛋白表达水平明显的降低（P<0.05）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP+CGRP8-37组的脑组织中p-JNK的蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与MCAO组相比，MCAO+CGRP组的p-ERK的蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP+CGRP8-37组、MCAO+CGRP+PD98059组、MCAO+CGRP+SB203580组的脑组织中p-ERK的蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与MCAO组相比，MCAO+CGRP组的p-P38的蛋白表达明显的降低（P<0.05）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP+CGRP8-37组、MCAO+CGRP+ERKPD98059组、MCAO+CGRP+SB203580组的脑组织中p-P38的蛋白表达水平均明显升高。4.脑组织JNK,P38免疫组化结果显示：与sham组相比，MCAO组脑组织中在脑缺血2h再灌注24h之后，可发现p-JNK，p-P38棕褐色的阳性细胞的数目明显增多（P<0.05），阳性表达增高主要位于脑组织缺血后缺血半暗带区域的位置；与MCAO组相比，MCAO+CGRP组阳性细胞的数目均明显减少（P<0.05）；与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP+CGRP8-37、MCAO+CGRP+PD98059和MCAO+CGRP+SB203580组的阳性细胞的数目明显的增加。脑组织ERK免疫组化结果显示：与Sham组相比，MCAO组脑组织中在脑缺血2h再灌注24h之后，发现含有棕褐色颗粒细胞的数目明显增多（P<0.05），其阳性表达的增高主要是脑组织缺血后的缺血半暗带区域的位置；与MCAO组相比，MCAO+CGRP组染有ERK抗体的阳性细胞的数目明显增多，尤其是在脑组织的缺血半暗带区。与MCAO+CGRP组相比，MCAO+CGRP+CGRP8-37、MCAO+CGRP+PD98059和MCAO+CGRP+SB203580组阳性细胞的数目明显的减少。本实验研究发现在大鼠脑缺血再灌注模型中，大鼠脑内能产生一定量的CGRP，但少量的CGRP不能保护脑缺血再灌注对脑组织中神经元的损伤。当增加外源性的CGRP时，脑组织存在足量的CGRP时能够对脑缺血再灌注损伤的神经元发挥保护作用。同时发现脑缺血再灌注时脑组织中的JNK信号通路、P38信号通路和ERK信号通路均被激活，也有研究报道JNK信号通路的活化能够介导神经元细胞的凋亡，P38MAPK信号通路也可能通过引发炎症反应而导致神经元细胞的凋亡，而ERK信号通路的活化在其中的作用仍存在争议，但有文献报道对神经元细胞可能发挥了一定的保护作用。通过本实验的研究发现，当增加外源性的CGRP时能够减少JNK和P38MAPK发生的磷酸化，而同时能促进ERK磷酸化的产生，在免疫组化中也显示了同样的结果，当增加外源性的CGRP时，能够使脑组织中p-JNK和p-P38明显的减少，而p-ERK表达水平增加。根据大鼠脑缺血再灌注损伤的脑组织的梗死面积计算发现，外源性CGRP的增加对缺血区脑组织中神经元细胞起到了明显的保护作用，同时在脑缺血再灌注时激活了JNK信号通路、ERK信号通路和P38MAPK信号通路，脑内大量出现的CGRP能够抑制JNK信号通路和p38信号通路的活化，而促进ERK信号通路的活化，这可能是脑组织中的CGRP使缺血区的血管扩张，使恢复缺血区的血供，而增加了脑组织中营养物质和氧气的供给，而使缺血区脑组织中与凋亡相关的MAPKs家族的JNK信号通路和P38MAPK信号通路被抑制，从而达到了保护神经元细胞的作用。当加入CGRP受体拮抗剂、P38MAPK抑制剂和ERK的阻断剂时，即使外源性的增加CGRP，也不能对脑组织中的神经元起到保护作用。结论1．外源性增加脑组织中CGRP的含量，对脑缺血再灌注大鼠的神经元细胞起到了重要的保护作用。2．CGRP的神经保护作用主要是通过抑制JNK信号通路及P38MAPK信号通路以及激活ERK信号通路实现的。3．CGRP受体在调控CGRP中起重要作用。