布鲁氏菌病(brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引发的目前世界上流行最广、危害最大的人兽共患病之一,威胁着人和60余种动物的生命健康。我国布病疫情在近几年急剧上升,布病已成为严重的公共卫生问题。布病的防控尤为重要,目前,布病实验室诊断主要技术包括虎红平板试验(RBPT),试管凝集试验(SAT),酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验(CFT)等,RBPT和SAT方法操作简便,结果便于观察,存在人为判断检测结果的主观性问题,且特异性不高,敏感性低;ELISA适合大批量血清学调查,但因其条件要求高,现场操作不便;补体结合试验敏感性(23.0-97.1%)和特异性(30.6-100.0%)都不稳定,且试剂昂贵,其应用受到极大限制。因此探索一种低成本、快速、特异的检测手段对于布鲁氏菌病的防控具有十分重要的意义。现有的血清学检测方法主要基于抗原抗体的反应,而目前国内布鲁氏菌抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,抗体试剂主要依赖于进口,但价格十分昂贵。制备高效价、特异性强、低成本的布鲁氏菌单克隆抗体可为布病防控提供有效试剂。基于交流动电效应的微粒操控电极芯片具有体积小、成本低、覆盖面广、灵敏度强、操作简便等优点,利用基于交流动电效应的微粒操控技术,可将传统的ELISA的检验时间从数个小时缩短到1分钟之内,同时还具有非常低的检出限,国外研究者已将该技术用来检测血清中的双酚A(BPA),寨卡病毒RNA、人体D-Dimer生物标志物以及测革兰氏阴性菌等,均取得了理想的实验结果。该技术有望用于临床疾病的即时检测。前期本实验室已经成功将该项技术应用于检测禽类新城疫病毒和猪圆环病毒抗体。本研究拟采用原核表达系统制备布鲁氏菌外膜蛋白BP26及Omp16,利用PEG1500细胞融合技术制备Omp16单克隆抗体,为布病防控提供有效试剂。此外本研究利用制备的抗原、抗体,采用11-巯基十一烷酸(MUA)在电极芯片表面自组装形成分子膜,其末端巯基可与电极表面金属形成金硫键,以1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳酰亚胺(EDC)和N-羟基玻珀酰亚胺(NHS)活化羧基,将重组蛋白BP26及Omp16共价固定于芯片电极表面,并对未结合位点进行封闭,减少非特异性吸附,初步建立基于微粒操控技术的布病抗体诊断方法,为布病的诊断提供了一种新的检测技术。本文的研究内容如下:(1)对布鲁氏菌Omp16和bp26基因进行密码子优化,化学合成Omp16和bp26全基因,在bp26基因的5’段和3’段分别设计酶切位点Nde I和Xho I。将合成的bp26基因进行NdeI和XhoI双酶切,酶切产物回收后,插入到同样经过NdeI和XhoI双酶切回收的pET30a(+)载体中,使用DNA Ligation Kit将bp26基因克隆于pET30a(+)载体中,构建重组质粒pET30a(+)/bp26;同时构建重组质粒pET28a(+)/Omp16。将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,构建重组基因工程菌pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)和pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)。通过筛选IPTG诱导条件(温度、诱导剂浓度、诱导时间),得出重组基因工程菌最佳诱导条件,按最佳诱导条件进行蛋白的大量诱导表达,利用His-tag镍柱纯化重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、二喹啉甲酸(BCA)法浓度测定及Western-blot鉴定。(2)以纯化的布鲁氏菌Omp16重组蛋白作为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,以PEG1500作为诱导剂进行细胞融合,融合后10天左右,通过间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,并采用有限稀释法进行2-3次亚克隆以获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,接种于小鼠腹腔诱生腹水制备单抗,对纯化所得抗体进行纯度、效价、亚类、浓度以及特异性测定;(3)将基于交流动电效应的微粒操控芯片用于布病抗体的检测。首先对微电极芯片的清洗条件以及自组装修饰条件进行优化,然后将纯化所得Omp16以及BP26抗原包被于微粒操控芯片表面,并进行封闭处理,制备微粒操控生物芯片,用于布病抗体的检测,分别从灵敏度、特异性、重复性三方面对该检测方法进行初步评价。结果:(1)成功构建重组基因工程菌 pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)和 pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3),通过筛选诱导条件发现,Omp16及BP26重组蛋白均为包涵体表达,pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)最佳诱导条件为 37℃,0.5 mmol·L-1 IPTG 诱导 8h;pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)最佳诱导条件为 37℃,0.5 mmol·L-1 IPTG 为诱导 6h。通过亲和层析镍柱纯化重组蛋白,并对纯化后重组蛋白进行浓度、SDS-PAGE电泳鉴定以及Western-blot检测,结果表明纯化所得重组蛋白达到了电泳纯,能够被His-tag组氨酸单抗特异性识别,说明成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出Omp16及BP26蛋白。(2)以纯化的Omp16重组蛋白作为免疫原,其进行了两次细胞融合,融合率分别为65.2%和89.4%,阳性率分别为38.5%和86.5%。共筛选出5株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5H1,3H1,3A3,5H11,3A11。吸取部分单抗杂交瘤细胞株细胞上清进行亚类鉴定,结果显示:单抗细胞5H1-2H-4D/4G/5F,5H1-4C亚型为IgG2a;3H-1H-4A.3H-1H-4G亚型为IgG1。取5H1-4C细胞株接种于小鼠腹腔内,诱生腹水制备单抗,经BCA法测定,纯化所得抗体浓度可达3.725mg/mL;经SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体纯度达到了 90%以上;经Western blot分析,在21 Ku处左右出现明显条带,与Omp16条带相符,表明所获得单抗是特异性针对Omp16抗原;将5H1-4C单抗作梯度倍比稀释进行ELISA检测,结果显示该抗体的ELISA效价达到1:1024000。(3)确定了最优的芯片清洗方法为异丙醇浸泡20 min,无水乙醇冲洗10 s,超纯水冲洗10 s后,臭氧清洗仪处理芯片20 min;最优芯片修饰条件为5 mM MUA室温孵育 30 min,200 mM EDC-NHS 23℃孵育 40 min。包被 Omp16 重组蛋白检测 0.2-500 ng/mL系列单抗稀释液,结果表明该芯片最低可以检测到10 ng/mL的Omp16抗体,且此时检测结果较为稳定。包被BP26重组蛋白检测经布病标准竞争ELISA试剂盒鉴定的布病阴阳性血清,共检测10份布病阳性血清以及6份阴性血清,每份样品检测5片芯片,与标准检测方法相比,其检测灵敏度(检出阳性率)达到96%,检测特异性(检出阴性率)达到95.7%,且该检测方法与其他常见牛羊病血清无交叉反应,检测结果表明该检测方法具有较高的特异性,可重复性良好。结论:本研究成功实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达布鲁氏菌外膜蛋白Omp16及BP26。通过两次细胞融合,共筛选出5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于微粒操控技术的布鲁氏菌病快速诊断方法,该方法具有较高的灵敏度、特异性强、可重复性较好,可用于布病实时定量检测,为布病的防控提供了新的检测技术和手段。